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生物咖啡茶


张韧

       最早知道细胞培养,是在大约20年前生物制药的细胞因子时期,唯一采用真核表达的重组人促红细胞生成素EPO是用CHO细胞表达的。那时也接收了一个概念,EPO表达量的多少是生产用的CHO好坏细胞决定的。

       2004年刚开始搞细胞培养基项目的时候,我们延续着这个概念,也就是客户的细胞我们管不了,我们只是努力仿制好已经有配方的进口细胞培养基。例如我们努力优化生产工艺,使得产品与进口同类基础培养基产品性能质量接近;我们与做过进口无血清培养基成分分析的单位或个人寻求合作;等等。那时候市场上的细胞培养基产品,也基本上都是MEM、DMEM、199、RPMI1640、DMEM/F12等基础培养基,以及一些昂贵的进口无血清细胞培养基。

       直到2005年,一个越洋电话中的一句话改变了我们的认识,由此带来国内细胞培养基发展理念的飞跃,进而实现动物疫苗上游生产工艺的升级。这句话就是:“好的细胞是靠好的培养基驯化而来的”。

       随后,我们在不多的资料中查到一些支持这个观点的文献。例如瑞士联邦科技学会生物工艺学教授 Wurm 博士在 2005 年即指出:“培养基虽不是细胞培养中唯一重要因素,但确是最重要的一种”。再就是LONZA 公司 2005 年研究结果表明,采用优化后的限定化学成分细胞培养基与目录细胞培养基相比,蛋白表达量提高了 9.6 倍。


1. 低血清培养基

       清大天一最早提出和实施的概念和产品是低血清培养和低血清培养基。当时我国疫苗生产中的细胞培养主要采用效率较低的转瓶,使用已有50多年历史的基础培养基,这些培养基在使用时需要添加较大比例的牛血清,有的还需要添加水解乳蛋白等动物成分。通过与疫苗企业合作试验,使用我们开发的完全化学成分低血清培养基对其生产中使用的VERO细胞和BHK21细胞进行驯化,使其适应低血清、无水解乳蛋白的培养液,同时增加产毒量,提高疫苗安全性,降低不良反应,降低成本。

       例如低血清199细胞培养基用于VERO细胞狂犬病疫苗生产,小牛血清添加量可降低至3%以下,并能使收液次数从2次提高到5次,病毒滴度有所提高。尤其是低血清MEM细胞培养基用于BHK21细胞口蹄疫疫苗的生产,小牛血清添加量可低至3%以下,无须添加水解乳蛋白,细胞分种比例提高,成本大幅度降低,在口蹄疫疫苗的生产中取得很好的效果。


2. BHK21细胞的悬浮培养

       2008年以前,国内动物疫苗均采用传统的转瓶细胞培养工艺生产疫苗,该方法存在细胞密度低、病毒产率低、生产成本高、劳动强度大等缺点。诞生于上个世纪六十年代的悬浮培养技术可以进行大规模细胞培养,能够获得大量的病毒产物和高质量的疫苗产品,在国外疫苗生产中普遍应用,而在我国一直难以突破。通过调研我们也了解到,有的疫苗企业尽管从国外买来BHK21悬浮细胞,但是用DMEM培养基加血清在摇瓶或磁力搅拌器中进行悬浮培养试验,结果细胞培养效果一直不好,甚至结团。

       当时国内已经有不少公司开始抗体药物研发,因为他们采用生物反应器无血清培养CHO细胞工艺,所以成为我们借鉴学习的榜样,参考CHO细胞无血清培养基的原理和主要成分,对贴壁的BHK21细胞边驯化边调整细胞培养基成分,终于在2008年实现BHK21细胞在生物反应器中低血清全悬浮培养,开辟了我国动物疫苗悬浮培养生产的先河。进而我们进一步优化细胞培养基,进一步驯化已经悬浮培养的低血清适应BHK21细胞,在2010年成功实现生物反应器无血清悬浮培养BHK21细胞生产口蹄疫病毒,在世界范围实现突破。

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全悬浮无血清培养BHK21细胞

       后来我们在《悬浮培养技术在生物制药中的应用和展望》一文中总结道:由于特定细胞的营养需求不同,实现其驯化的难易程度也不同,在驯化时需要选用合适的细胞培养基,有针对性地补充某些营养成分以满足细胞的特定需求,使驯化好的细胞可以保持其悬浮或是无血清生长的特性。例如通过在细胞中添加一定的保护剂,常用的Pluronic F-68,其作为一种表面活性剂,已广泛用于哺乳动物细胞的大规模培养中。有些细胞可以使用PEG改变培养液的表面张力来实现保护效果。与20 世纪 80 年代相比,由于细胞培养基技术的发展,细胞驯化变得相对容易。

3. CHO细胞表达量的提高

       与疫苗生产的各种细胞不同,CHO细胞的组成比较复杂,不仅有贴壁细胞,有悬浮细胞,悬浮细胞又有CHO-K、CHO-DG44、CHO-S等很多亚型,而每一种亚型所要表达的药物也有很多种,培养工艺也有所不同。这些复杂性和特殊性无法以一种万能培养基解决,因此几乎各村都有各村的高招。

       然而CHO细胞无血清培养基也不是完全没有原理和规律所寻,它们基本上是以DMEM/F12作为基础培养基,添加其它所需要的成分通过高通量筛选试验而得。

       CHO细胞无血清培养基曾经分为量大流派:含有植物水解物的无血清培养基和化学成分限定的无血清培养基。因为前者开发起来相对容易,且成本相对低,自然成为我们当时的选择。我们当时开发的几种CHO细胞无血清培养基虽然在细胞生长方面表现一般,但能明显提高蛋白表达,因此也能够被一些用户所使用。

       当时清大天一还有一项业务,是为用户新药研发项目提供临床前用药批量生产服务。这时候用户交给我们的基本上是实验室的产物,细胞表达量往往较低,使用商业化的进口细胞培养基,也没有反应器培养工艺,为此我们在进行大规模生产之前,需要使用我们的细胞培养基对其进行适应性驯化,这样能够提高其表达量几倍甚至十倍以上。

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全悬浮无血清培养CHO细胞

4. 更多贴壁细胞全悬浮驯化

       与贴壁细胞培养相比,全悬浮细胞培养培养工艺及放大工艺容易控制,操作简单且成本较低,因此,贴壁细胞悬浮化是工业化的研究热点。除CHO细胞、BHK21细胞实现悬浮化培养应用于生物制品生产外,另外一些新的经过筛选适应后的细胞系,如MDCK 33016®细胞、HEK-293细胞、PER.C6®细胞、EB66®细胞、 AGE1.CR® 细胞等,已经特异性的用于病毒疫苗生产,并且这些细胞系均能够在无血清条件下悬浮生长,生产工艺简单且产品表达量较高。国际上许多知名生物制品厂家也纷纷通过细胞改造、筛选及驯化技术,发展出自己专用的细胞培养平台进行生物制品的生产,如Baxter公司的Vero细胞培养平台、Crucell公司和赛诺菲巴斯德合作开发的PER.C6®细胞养平台,GSK、Chiron及诺华公司的MDCK细胞培养平台等。因此,通过筛选和驯化,在生物反应器中实现不同细胞的全悬浮培养或者是无血清悬浮培养后,由于生物反应器大规模培养细胞自身所具有的优势,结合相应的细胞培养基和生产工艺的优化,最终较易达到提高产率及产品质量的目的。

       与CHO细胞、BHK21细胞相比,疫苗生产中常用的VERO细胞、MDCK细胞、ST细胞、PK15细胞、MARC145细胞等贴壁细胞的全悬浮驯化要困难得多。国内也有不少机构在这方面做了长期大量工作和努力,并已经在一些细胞上取得不错的进展和成功,这其中细胞培养基起着极其重要的作用。根据细胞特点对细胞培养基进行优化是能否驯化成功的关键。

(1)MDCK细胞全悬浮驯化
       目前国内采用无血清全悬浮培养MDCK细胞生产禽流感疫苗已经获得成功,这是一个很大的进步,是禽流感生产工艺的突破性升级。也是国内动物疫苗行业多年研发努力的结果。
       多年前,我们曾经参考国外文献中的方法,采用转染技术克隆筛选悬浮细胞,经过很长时间试验,虽然细胞可以悬浮,但是细胞生长的密度和活力很差,因此没有实质性的成功。
       而现在,国内已经有一些企业介绍采用直接驯化的方法,成功全悬浮驯化MDCK细胞的案例,这其中细胞培养基起着至关重要的作用。
       以下所列举的所有案例均为笔者得到的信息,不代表这些信息经过笔者验证。同时也不代表只有这些公司拥有相应技术

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爱科生物驯化的全悬浮MDCK细胞

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天信和驯化的全悬浮MDCK细胞

(2)PK15细胞全悬浮驯化
       按照目前转瓶生产工艺,PK15细胞生产高品质猪圆环病毒疫苗的成本较高,如果能够实现PK15细胞全悬浮培养,则可以突破这一成本瓶颈,使得圆环病毒疫苗整体水平大幅度提高。
同样,现在国内已经有一些公司介绍采用直接驯化的方法,将PK15细胞成功实现全悬浮培养,这其中细胞培养基同样起着至关重要的作用。

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爱科生物驯化的全悬浮PK15细胞

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天信和驯化的全悬浮PK15细胞

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甘肃健顺采用自行开发的无血清培养基驯化的全悬浮PK15细胞


(3)其它贴壁细胞的全悬浮驯化,例如VERO细胞,有文献报道国际知名企业对 Vero 细胞、PER-C6 细胞等进行悬浮化培养并已获成功。国内也有公司介绍,通过驯化已经建立了Vero-E6细胞、MARC145细胞、ST细胞等全悬浮培养平台,都是采用适合的细胞培养基直接驯化的方法。

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爱科生物驯化的全悬浮VERO-E6细胞

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爱科生物驯化的全悬浮MDBK细胞

       贴壁细胞经过驯化实现全悬浮培养后,对病毒的敏感性或者产毒量也许有影响,可能同样需要使用适宜的细胞培养基进行病毒的适应和驯化。

       现在,在细胞培养基厂商的产品目录中,首先看到的都是各种细胞的低血清培养基、无血清培养基等个性化细胞培养基,基础培养基已经退到次要位置。但愿这些细胞培养基的供应商都理解本文的观点,并具有根据用户实际情况开发个性化细胞培养基的研发能力,而这也是作为用户的疫苗选择供应商的关键要素之一。

       最后补充一点,细胞驯化时候的培养基至关重要,而这些细胞培养基的成本控制同样重要,因为驯化成功后的细胞培养是要进入到生产应用中去的。



参考文献
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10 王建超,常用细胞悬浮培养技术及其动物疫苗中的应用,银水湾论坛第一届年会发言PPT,2016-8-3。


发表于 2016-9-12 22:28:42 | 显示全部楼层 |阅读模式

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