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生物咖啡茶

凭他百炼钢,力化绕指柔
——新形式下重大动物疫病疫苗车间建设生物安全技术应对策略探讨(二)

作者:老梁
以下内容仅为个人观点,不代表任何组织,欢迎各位大咖多批评指正!
       打狼,是需要勇气滴!打狼,是需要技巧滴!俗语说“舍不得孩子套不着狼”,我老梁偏不信这个邪!在大规模工业化强毒疫苗生产车间的生物安全领域,咱的目标就是,既保得住“孩子”,也套得着“狼”。

       生物安全是个纷繁复杂的系统工程,贯穿于生产车间(或实验室)的设计、建设、验收、认可、运行、监管等诸多环节。在老梁看来,生物安全建设的全面性、匹配的科学性,以及安全冗余与投资和运行费用的平衡,是建设时需要重点考虑的地方。

       在写完“应对策略探讨(一)”后的两周,老梁走访了一些企业,也和生物安全领域里的众咖做了交流,得到了一些新的信息和知识,了解了不同领域或企业的想法和观点。期间还抽空旅了把游,去了趟国内较大的城市——海拉尔。在内蒙古广袤的大草原上,一边吃着手把肉一边为中国女排加油,当然同时也念念不忘对我国兽用强度疫苗车间领域的生物安全建设做了些思考……不管你信不信,反正我信了。

       和之前一样,本文仅为老梁个人观点,不同的是这次完全脱离了两个所谓“实验室”规范的束缚(其实很多内容和原则在根儿上还是一致的,只是不再纠结于 “简单套用”罢了),在这里梳理出若干针对车间生物安全建设的关键点,大家探讨一番,引一引玉,如此而已。


关于车间

伤不起的圈地运动”——车间的防护区在哪里?

       生物安全实验室防护区的概念这里不再赘述,我想对于车间而言,如果想要规范生物安全要求,也应当圈定出不同防护等级的区域,加以区别对待,这样做的目的应该有两个:
       第一, 对于高风险区域,应当采取较为严格的生物安全控制手段;
       第二,对于较低风险区域,可以适当简化生物安全措施,以降低初投资和运行成本。

       车间生产的上游和下游还有一定规模的非生物安全区(如口蹄疫车间的BHK-21细胞系培养、乳化、分装、轧盖等;禽流感车间的前孵、乳化、分装等),这些区域完全可以设置为正压区,有企业问我,车间改为“三级”,是不是所有环节均要求全新风、负压等,我想大可不必!

       下面先以口蹄疫为例,探讨一个车间生物安全等级划分模型。

       首先,由于目前我国口蹄疫疫苗生产基本均为全悬浮培养技术,生产工艺为密闭罐体和管道的连接,几乎没有暴露环节,因此最多将毒区定性为二级屏障环境,美国标准1和中国标准2在关于屏障的分类上基本相似,结合生产工艺,可以认为生物安全区域(或俗称的负压区)包括病毒培养、浓缩纯化(灭活前)、灭活、QC质检等区域。由于灭活前浓缩纯化可减少灭活罐的体量和负担,且杂质少好灭活,因此虽然增加了生物安全风险区域,从工艺上而言还是以灭活前浓缩纯化为佳。这是典型的以工艺为核心的设计思路,由此所带来的生物安全风险和代价企业是要认的!

       其次,各家企业在灭活工艺上肯定不尽相同,各有神通。为假设模型具有普适性,这里以OIE推荐工艺方法作为分析基础。根据灭活动力学,结合2006年起OIE推荐的3mmol/LBEI 两次灭活法,即26℃分两次共灭活48h的方法,使疫苗安全性更高,病毒粒子146S保持更完整3。根据曲线推算最终灭活终点应为每10000L液体制备物中感染粒子少于1个4。此法相对于OIE在2000年起推荐的1mmol/L BEI 两次灭活法(效果已然较好),由于加大灭活剂用量,效果更佳!因此在灭活Ⅱ段,其生物安全风险已大大降低。另外,抗原的浓缩与纯化法以沉淀法为例,考虑到灭活后的浓缩与纯化主要为PEG(聚乙二醇)的沉淀3,理论上甚至可以是正压区域,因此其生物安全风险也不高。综上所述,根据工艺及风险评估,这里提出口蹄疫生产环节生物安全等级划分模型如表1(仅供参考):

表1:口蹄疫灭活苗生产车间生物安全等级区域划分模型
   
序号
   
功能区域
级别划分
应对策略
备注
1
细胞培养
无风险区
正压、回风
BHK-21细胞系培养
2
乳化
 
3
分装
 
4
轧盖
 
5
其余上游环节
包含培养基制备等
6
精洗区
 
7
公共区(如果有)
包含公共走廊、洁物暂存、洁具等
8
浓缩纯化
低风险区
根据风险评估确定:
  
方案:正压、回风;
  
方案:负压、回风、排风双高效。
包含其辅助人、物流环节
9
灭活Ⅱ(如果区分)
根据风险评估确定:
  
方案:负压、回风、排风双高效;
  
方案:负压、回风带高效、排风双高效。
包含其辅助人、物流环节
  
如灭活未区分,则应在高风险区
10
病毒培养
高风险区
根据风险评估确定:
  
方案:负压、回风带高效,排风双高效;
  
方案:全新风,排风双高效;房间一道,排风总管一道。
包含其辅助人、物流环节
11
离心机间
房间必须降噪处理
12
灭活
如灭活未区分,则应在此高风险区
13
活毒废水处理间
生物安全等级与车间同
14
QC检验
生物安全等级与车间同

       对于高致病性禽流感生产车间,经与业内诸咖交流,老梁学习到以下几点:
       1.    目前全国高致病性禽流感生产车间使用的毒株统一来自哈兽研,均为重组表达类型;
       2.    基于片段重组表达的病毒毒性较全病毒偏弱(对不起这里本想用定量的语言,但难为我老梁确实不是这个领域的,也就表达个意思!);
       3.    车间可能存在的生物安全风险在于(但不限于):
              ①  交叉污染;
              ②  鸡胚培养过程中可能的复壮导致人员感染;
              ③  重组病毒的稳定性欠佳导致跟其他病毒的再重组等。

       基于以上几点,老梁认为对禽流感生产车间所谓“三级”的生物安全要求相对于口蹄疫车间可以适当降低,比如如果一定要全新风,是否可以只考虑后孵、收获阶段;比如是否可以不采取全新风方式,依然维持回风方式,但须在回风加装高效且保证系统绝对负压等等。当然,不论如何,相对于目前生产标准有所提高是理所应当的。

       这里之所以将车间负压区域或不同种类车间人为的加以区分,主要是希望将来在应对策略上能有一定的灵活度。假设最终的标准要求是这两类车间必须采用全新风方式,则老梁建议是否可以根据不同的生物安全要求将不同域(车间)划分出三六九等,论一论“成分出身”,搞一搞“级别歧视”:对局部“高风险”区域采用全新风方式,较低风险区域可采用绝对负压回风系统,回风可带高效。

       目前老梁的团队正在结合我国北方某一FMD车间实例进行建模,通过理论模拟计算与实证研究对比(现场检测),对大规模工业化口蹄疫生产车间的全新风系统与回风系统进行全年8760h的空调系统运行能耗分析,根据早前我方调研情况,空调通风能耗占兽用疫苗车间总体能耗的80-90%。我们希望能够通过研究帮助口蹄疫或禽流感企业建立能耗对标体系,让大家对自身将来可能的能耗情况有一个粗略的概念,该工作正在进行中,如有企业感兴趣,可与我们联系,也许我们需要您的帮助和支持。

关于动物房
住“独栋”,吹空调,这年月,动物房价也上涨
       口蹄疫用大动物房,从使用功能上来讲,这基本上就是大动物P3实验室。老梁在“应对策略探讨(一)”中已经述及,如按CNAS实验室标准,国内目前基本上是全军覆没的,但如果不采用此标准,而是根据我国实际国情制定农业部自己的三级标准,则在很多问题上要灵活的多。

       但是,不论标准制定成什么样,高标准的大动物检验实验室建设将耗费巨资是个不争的事实!其实一直以来我国专家也在致力于“3R”研究(Replacement,Reduction,Refinement),致力于研究建立抗原量和保护的关系以及抗原量和免疫反应的相关性后用抗原定量检测法来代替动物攻毒实验5。这里做一个假想,也许未来某日全国毒株统一(大家打一打擂呗,我们不怕看热闹),企业仅以标准的146S检测方法进行检测,必要时只需检一批PD50即可。这样势必大大减少企业本动物用量,大动物房规模也将随之缩减。当然农业部依然进行本动物检验。

       以上仅为设想,开个脑洞而已,当不得真。就目前而言,企业的动物房该建的还得建啊,但老梁建议企业可以按预留设计思路考虑,分步观望实施。

       再来一个基于OIE推荐方法的大动物检验动物房假设模型:
       根据OIE标准,一批PD50检验需用来自无疫区(这也是个悖论,我国是强制免疫口蹄疫的,神奇吧!)至少6个月龄牛不少于17头;
       将其中15头分3组,每组不少于5头,按1,1/4,1/16(我国为1,1/3,1/9)头份计量接种6,另有两头对照,要求疫苗效力不低于6PD50。
       文献7给出了美国动物福利要求,350公斤为5.4m2/头,需要动物净面积约91.8平米,按毛净面积比4:18计算,最小需要的大动物P3实验室理论面积为400平米;
       考虑一倍的实验室使用冗余,或对牛、猪实验室加以区分,则实验室占地面积考虑为1000m2。
       按最简“盒中盒”模式进行假设,分为地下一层,地上三层,总建筑面积约3500~4000m2。假设的建设模型见表2:

表2:按最简“盒中盒”模式进行的大动物P3检验实验室模型
   
楼层
   
内容
面积
   
m2
备注
地下一层
动力站、活毒废水处理间、动物尸体处理间(下游)、管道夹层等
500~1000
可局部
地上一层
实验区、动物房、解剖间、动物尸体处理间(上游)、大厅、办公、交通核(楼、电梯)、辅助区等
1000
大动物室为钢筋混凝土结构:
  
气密门、穿墙密封器、生物型密闭阀、生物安全柜、生物型高压锅、生物型传递窗、生物型渡槽、化淋及生命支持系统(可选)等
地上二层
管道层
1000
空调通风管道、公用工程介质管道、压力无关阀门、高效过滤单元等
地上三层
设备层
1000
/排风机组、BIBO、化淋装置(可选)等
合计

  
3500~4000

       根据国内同类型项目建设经验,如严格按CNAS要求的生物安全实验室标准,工程造价(不含科研设备)约在0.8~1.2亿左右。

单走廊还是双走廊,这是个问题

       在平面布局中,虽然不论我国规范还是国外资料,均未对单、双走廊做出明确规定,即单、双走廊均可以接受。但在实际使用过程中,大动物区域显然使用双走廊系统能更好的避免走廊的交叉“污染”9


References
1 Manual 242.1 - ARSFacilities Design Standards 9.1.5 224-225
2 实验室生物安全通用要求 GB19489-2008 (4.1)4;
3 刘湘涛 张强郭建宏 口蹄疫,(8.2.7)359;
4 NB: Version adopted by the World Assembly ofDelegates of the OIE in May 2009 OIE Terrestrial Manual 2009 1 CHAPTER 2 1.5.FOOT AND MOUTH DISEASE 20
5宁宜宝等兽用疫苗学222
6 NB: Version adopted by the World Assembly of Delegatesof the OIE in May 2009 OIE Terrestrial Manual 2009 1 CHAPTER 2 1.5 .FOOT ANDMOUTH DISEASE 20
7 Peter Mani Paul Langevin Veterinary ContainmentFacilities 《兽医生物安全设施》 张仲秋等译(6.3.1)116;
8 Peter Mani Paul Langevin Veterinary ContainmentFacilities 《兽医生物安全设施》 张仲秋等译(6.3.4)118;
9 Peter Mani Paul Langevin Veterinary ContainmentFacilities 《兽医生物安全设施》 张仲秋等译(6.4)119;

       另外,强烈建议各位在初秋时节如有机会,去呼伦贝尔大草原感受一下风景与美食!和站在大海边一样,感觉人是渺小的,和站在大海边不一样,你身临其中!不论是胆战心惊的在马背上溜达,还是蒙古包里与蚊虫博弈,都让你真实感觉存在于自然之中。牧场上散养的动物总是那么自由,你看到的每一头牛,都像王小波笔下的那头猪一样特立独行,你看到的每一只羊,都有着桀骜不驯的眼神和富有磁性的嗓音。在星空下无所事事是那么美好,那一刻心中只有一个想法:青山在远,秋风欲狂。世间破事,去他个娘!

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本文系生物咖啡茶原创编译,欢迎个人分享,转载须保留译者姓名,并注明转自生物咖啡茶。谢谢!

发表于 2016-8-31 22:27:55 | 显示全部楼层 |阅读模式

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