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生物咖啡茶

本帖最后由 都是过去 于 2016-2-5 11:37 编辑

         工业应用的工程细胞系不仅要能够正确表达重组蛋白,还需满足“生长能力强,表达水平高、遗传稳定性”的特性以及无外源因子污染等要求。用于抗体及蛋白生产的宿主细胞最主要是CHO细胞(图1为生产“重磅炸弹抗体”所采用的CHO细胞的发展进化图谱,CHO S、K1、DXB11、DG44),人视网膜细胞系PER.C6TM等,用于人用疫苗生产的主要是Vero细胞和MRC52BS等二倍体细胞,用于兽用疫苗的主要是BHK21细胞、MDCK细胞、Vero细胞、PK细胞、ST细胞和Marc145细胞等。
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1  CHO 细胞进化图谱,源于Nature Biotechnology, 2011,vol29(8)



      常用动物细胞系购买,通常有几种途径:

      
工程细胞系构建过程中,所涉及到最关键是载体表达系统的构建,目前商业上应用动物细胞表达系统为:
  • DHFR Expression System(Invitrogen)
  • GS Expression System (Lonza)
  • UCOE™ Expression Technology (Merck Millipore)
  • GPEx® technology  (Catalent)
  • CHEF1TM Expression Technology (CMC)
  • Selexis’SURE Technology Platform (SELEXIS)

      
       细胞生长到生长稳定期或者进入衰亡期之前需要及时传代。细胞的传代代数与细胞的世代(增殖代数)并不是同一个概念,国内常常混肴。在细胞培养时,所说的“第10代细胞”,仅指该细胞已经传代10次;细胞传一代后,一般能倍增3~6次。根据我国药典三部的“生物制品生产用动物细胞基质制备及检定规程”,二倍体细胞的代次是指一世代,即细胞群体数量增加一倍即为一代次;对于传代细胞系,以一定稀释倍数进行传代,每传一次即为一代。用于生产的传代细胞系,代次都有一定的限制。

       生物制品生产工艺的开发过程简单如图2所示。细胞库通常是三级管理,即原始细胞库(PCB)、主细胞库(MCB)、工作细胞库(WCB),其中MCB和 WCB需要检定合格后并分别存放。BHK21、CHO细胞等传代细胞系已证明具有致瘤性,可不必做致瘤性检测;但Vero细胞因其在一定代次内无致瘤性,则必须做致瘤性检查。
生物制品生产工艺开发流程示意图.png
图2 生物制品生产工艺开发流程示意图

       因为细胞系构建技术和动物细胞大规模培养技术的日臻成熟,流加培养工艺的细胞密度可以达到1.5-2×107cell/mL,灌注培养工艺细胞密度可以达到2-5×107cell/mL,抗体生产效率可以达到100-500mg/L/day。

       SFDA、FDA、EMEA对于仿制药的疗效和质量与原研药一致性评价工作的要求越来越严,而抗体等有活性的生物大分子的最终表达,需要经过糖基化修饰、脱酰基化、异构体、二硫键错配等翻译后修饰,以及多聚体、降解的发生,细胞培养过程工艺技术对抗体药物对重组抗体质量的研究也影响日益。

       在动物细胞生产抗体的工艺中,随着表达量的提高,聚体形成的比例越高,甚至影响到后期纯化效率。影响聚体形成的原因有物理参数(温度、pH,DO等)、培养基成分(如Cu2+、谷胱甘肽、胱氨酸、半胱氨酸等)等因素。通常通过优化培养基中硫酸铜、胱氨酸含量,改变pH和渗透压等方法,减少细胞培养过程中多聚体的生成。细胞培养工艺能直接影响抗体的糖基化修饰程度:宿主细胞状态、培养参数(DO、温度、pHpCO2)、培养工艺(灌注、流加),均会对抗体的糖基化程度造成影响。

                                                                                                                                      2016.02.03写于CA1883





发表于 2016-2-4 18:17:05 | 显示全部楼层 |阅读模式

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该帖共收到 11 条回复!
您这里介绍的主要是传代细胞,能不能介绍一下工业中应用的原代细胞培养培养?例如地鼠肾细胞。
发表于 2016-2-5 11:39:55 | 显示全部楼层

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另外,想替QQ群的用户咨询您一个问题:鱼肾细胞CIK培养,传代24小时,细胞贴壁约80%,第二天就会有大量脱落,细胞贴壁只有40-50%。如何考虑来解决?谢谢!
发表于 2016-2-5 11:43:33 | 显示全部楼层

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都是过去 发表于 2016-2-5 11:39
您这里介绍的主要是传代细胞,能不能介绍一下工业中应用的原代细胞培养培养?例如地鼠肾细胞。 ...

目前国内生产人用狂犬疫苗有应用原代地鼠肾细胞或连续传代不超过5代的地鼠肾细胞。有客户曾经用低血清培养基加3%血清培养原代地鼠肾细胞,在获得相同细胞量的前提下,血清用量降低50%,地鼠使用量节省30%。
发表于 2016-2-5 20:23:20 | 显示全部楼层

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biopro 发表于 2016-2-5 20:23
目前国内生产人用狂犬疫苗有应用原代地鼠肾细胞或连续传代不超过5代的地鼠肾细胞。有客户曾经用低血清培 ...

与传代细胞相比,原代细胞有哪些优势和劣势?使用原代细胞是因为有其不可替代性的因素,还是为了申报新药有利的原因呢?
发表于 2016-2-5 20:33:17 | 显示全部楼层

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都是过去 发表于 2016-2-5 11:43
另外,想替QQ群的用户咨询您一个问题:鱼肾细胞CIK培养,传代24小时,细胞贴壁约80%,第二天就会有大量脱落 ...

鱼肾细胞CIK在48小时后脱落,可能与几方面有关:1、鱼肾脏组织用0.25%胰酶消化火候没掌握好,细胞是否有受损,2、细胞接种密度是否合适,一般在每毫升三到八百万细胞,3、培养的pH(7.2-7.4)、温度(28度),甚至细胞培养基是否合适等等?
发表于 2016-2-5 20:37:31 | 显示全部楼层

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都是过去 发表于 2016-2-5 20:33
与传代细胞相比,原代细胞有哪些优势和劣势?使用原代细胞是因为有其不可替代性的因素,还是为了申报新药 ...

个人认为,原代地鼠肾细胞生产狂犬疫苗是疫苗生产工艺技术的某种意义上的“退步”,无论是无菌控制,还是生产过程的“残忍”,肾组织消化的不均一导致细胞质量的不一致等等.......但因为原代细胞的DNA残留的安全性优于传代细胞,Vero细胞在一定代次之内被认为是无致瘤性的,而且我们国家对狂犬疫苗的DNA残留含量要求是全世界最严标准,所以企业选择用原代细胞,可能部分也出于更快获得新药注册、生产的需要。
发表于 2016-2-5 20:46:20 | 显示全部楼层

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本帖最后由 都是过去 于 2016-2-5 20:59 编辑
biopro 发表于 2016-2-5 20:37
鱼肾细胞CIK在48小时后脱落,可能与几方面有关:1、鱼肾脏组织用0.25%胰酶消化火候没掌握好,细胞是否有 ...

接种密度降低一些、血清比例降低一些,会不会也有可能改善?
发表于 2016-2-5 20:48:29 | 显示全部楼层

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本帖最后由 都是过去 于 2016-2-5 20:53 编辑
biopro 发表于 2016-2-5 20:46
个人认为,原代地鼠肾细胞生产狂犬疫苗是疫苗生产工艺技术的某种意义上的“退步”,无论是无菌控制,还是 ...

谢谢!我有同感。而且我感觉我国对狂犬病疫苗DNA残留的指标过于苛刻了,高于发达国家要求的不一定就是先进水平。
发表于 2016-2-5 20:52:13 | 显示全部楼层

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我们国内公司,有没有既能构建工程细胞、又研制该细胞的专用细胞培养基,甚至开发其工艺技术的公司呢?
发表于 2016-2-5 21:06:29 | 显示全部楼层

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