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生物咖啡茶

       Dr. Joerg von Hagon在本文中重点讨论了生产优质、可再生的GMP培养基需考虑的各种关键因素。

       哺乳动物细胞培养技术在生物制药行业已经发展成为一块重要的领域,培养基的质量对很多关键过程产生重大影响,从研发设计中的细胞生长到新生物实体的关键质量属性,无不涵盖其中。生物药品,比如单克隆抗体和重组蛋白,在生物制药设施内完成生产;而这些设施或用于临床或用于商业化用途,使用大规模细胞培养生产工艺,而该生物工艺越来越依赖现成的粉末型培养基。

       生产优质、可再生的GMP细胞培养基关键在于三大因素:配方优化、原料质量以及生产工艺。从技术上说,尽管两批培养基可能由相同的配方组成,但如果原材料的质量和/或生产工艺不一致,其性能表现可能会截然不同。对原料进行恰当选择、检验以及预加工,做到起始原料质量最高、支持培养基性能优化,这个过程非常重要;包括磨粉、混合和包装的生产工艺必须加以控制以及足够温和,避免原料降级。因此,为了能够生产从公斤放大到吨级、各批次质量一致的粉末型培养基,生产厂商执行能生产出同等原料和加工质量的工艺,这尤为关键。

       达尔波克改良培养基(DMEM/F12)是常用的哺乳动物细胞培养基,由各生产商提供的该培养基都含有标准的粉末型配方。尽管如此,默克公司对DMEM/F12进行了基准研究、评估不同供应商间该培养基的差异,它从数家供应商那里获取了粉末型DMEM/F12样品,并对它们进行大量的理化和性能实验。

并非如此一致

       尽管有标准的配方,不同厂商生产的DMEM/F12粉末型培养基外观看起来大为不同,其颜色范围从白色到浅黄到粉红。既然配方相同,这些颜色差异很可能是不同生产商使用原料的质量和/或生产工艺的变化结果,并意味重要的理化特征,包括pH值、渗压强度、湿度和颗粒分布因样品实际情况变化而变化。这些理化特性的每一项指标都是哺乳动物细胞培养的关键参数,即使微小的差异也可能影响到培养基的性能。

       保持培养基最佳pH值(7.4)和渗压强度(0.29 osmol/Kg)对细胞活性和生长非常关键。生产商S提供的细胞培养基在这两项指标上出现明显变化;特别是,该样品的平均渗压强度,比预期的DMEM/F12配方正常的标准渗透压强度低0.4。在后续的溶解度测试中,所有样品都没有观察到沉淀现象;因此,所有粉末都可溶。

       水分含量或湿度,对粉末型培养基的稳定性和存储期产生直接影响。除了选择恰当的包装材料外,培养基生产商落实优化的生产流程非常重要,该流程在整个生产和存储阶段从选材开始,维持非常低的水分含量(~1%)以避免微生物的增生。正因如此,在生产过程中应经常监测水分含量。所有DMEM/F12样品选择费舍尔滴定法进行水滴定分析。在提供的样品中,观察到湿度的变化,其中的一些湿度接近或超过1.2%的水滴定值。

       颗粒度分布是生产工艺中必须加以控制的重要一环,因这些粉末不是在无菌条件下生产,它影响到分层效果、溶解度、氧化和微生物降解。每一个DMEM/F12培养基样品通过空气喷射筛测定颗粒度分布并观察到两种类型的颗粒缩减效应,一类样品遵循线性分布,另一类样品更接近于对数分布,遵循线性分布的粉末型培养基,在分层试验时的观察到其处于下层。

       除了理化性质测定外,为了测试培养基性能,对中国仓鼠卵巢(CHO-S)进行分批培养性能测试。大约每毫升播种了1×10^5个CHO-S活细胞,让其生长数天。(如图1)它显示出四天后DMEM/F12样品活细胞密度变化高达50%。

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图1:使用不同生产商的DMEM/F12粉末型培养基进行CHO-S分批培养性能测试

       总的来说,从DMEM/F12培养基基准研究得到的理化数据和性能表现可归结为,不同生产商提供的标准配方粉末型培养基在理化性质和性能表现实际上并非一致。除了配方优化,为了实现培养基性能的最优化,其厂商必须执行可靠的优质原料和加工工艺。

培养基性能预测

       虽然测定培养基质量和性能效果明显,但是DMEM/F12基准研究使用的分析评估方法却是费时劳力的过程,特别是对每一批的新培养基进行完整的测试。默克公司采用了较为简单的“指纹识别”技术,该技术能够快速准确的预测培养基的性能而不需要完整的分析测试。这些测试方法包括主成分分析(PCA)、核磁共振图谱分析(NRM)以及超高液相色谱(UPLC)。

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图2:主成分分析:细胞性能和近红外光谱分析的联系

       主成分分析(PCA)是数据分析的标准工具,它能从复杂的数据集从提取相关的信息。对于培养基性能,主成分分析显示培养基样品的近红外图谱包括足够的理化信息,可以准确地预测培养基的性能(如图2)。该预测工具能用于识别质量差别和批次间的差异。一个特定的主成分分析值并不确定培养基的性能高低;而是,从过往批次中得到参考,该特定的主成分分析值能够匹配到到较高或较低的性能批次中。在该模型中,随着数据从左上象限移动到右下象限,预示着细胞培养性能的提升。

       如果主成分分析预测为低性能,则该培养基的问题可能出在原料的杂质或者因生产工艺导致的原料降级。这个问题可以通过NMR和UPLC图谱法进一步分析,然后进行恰当的处理。

       为了定量分析样品中各种氨基酸,对不同生产商提供的、扩大到13个不同批次的一组DMEM/F12培养基进行核磁共振图谱分析。在这种情况下,由于一些样品氨基酸浓度的变化,L-丙氨酸、L-缬氨酸、L-亮氨酸、L-谷氨酸和L-酪氨酸五种氨基酸表现敏感(如图3)。例如,发现一些批次的培养基只有DMEM/F12配方中L-缬氨酸和L-酪氨酸预定浓度的一半。使用超高液相色谱分析DMEM/F12培养基样品组,识别可能影响培养基性能的潜在杂质(如图4)。在各批培养基批次中,只有一批出现前峰,这表明了在生产过程中原料降级已经发生(这一结论后续通过核磁共振分析得到证实)。因此,在确认了培养基中低性能的批次后,其潜在杂质即可以定性和定量分析。


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图3:不同生产商提供的DMEM/F12粉末型培养基通过NMR图谱分析进行氨基酸定量

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图4:UPLC测定DMEM/F12粉末型培养基在生产过程中出现原料降级

       总之,为了预测培养基质量,优质原料、避免原料降级的温和生产工艺以及恰当的分析方法,对于培养基厂商来说,这些都是非常必需的要求。

从公斤级到吨级

       粉末型培养基放大生产对于大多数规模化的生物制药厂商来说都是一个重要的议题,因为需要确保规模化生产各批次产品的一致性。Merck 公司采用最先进的cGMP生产设施,为客户定制批次生产产量高达2.5吨的细胞培养基,并从能够符合其质量标准的合格供应商那里采购原料。这些原料的检验标准确保各单一原料批次间质量的一致性。

       使用合格的原料,从1公斤级别放大到2.5吨,Merck公司对DMEM/F12粉末型培养基的可重复性和扩展性进行了评估。该粉末型培养基通过研磨技术、使用原料组合(组合A)在实验室规模(多达1公斤)、中等规模(多达100公斤)和大规模(多达2.5吨)下进行生产;采用相同的配方、相同的生产工艺,但是完全不同的原料组合(原料组合B,于6个月后采购),在6个月内进行另一大规模的批次生产,然后评估各批次的pH值、渗压强度、溶解性能、颗粒度分布和细胞性能。

       不管使用的是哪种生产规模或原料组合,培养基的所有理化参数都几乎相同。如图5所示,从小试到大生产或使用不同批次的原料(原料组合A和B),颗粒尺寸保持几乎相同,分别证实了扩展性能和批次间质量的一致性。这些数据证明,Merck 公司进行的粉末型培养基放大和规模化生产是高度可控的过程。


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图5:颗粒尺寸的一致性验证了8a(当采用不同的原料组合8b,证实批次间质量的一致)从小试到大生产的可扩展性。在所有的原料中(相隔时间>半年),原料组合A和B是完全不同的批次。颗粒度通过激光衍射测定。

需考虑的关键因素

       DMEM/F12基准研究证实来自不同生产商的粉末型培养基尽管有标准的配方,但仍存在明显的差异。因此,光配方组合并不能确定培养基的性能;原料的质量和加工工艺对生产一致的、高质的GMP培养基发挥了关键作用。这些因素在保留必需参数的情况下,对生产的扩展性尤为重要。

       三大要素共同促成优质原料:生产过程,符合最佳实践;原料合格检测制度,确保单一成分质量一致以及预处理流程,确保各组分表面积合适、溶解性能最佳。而且,另三大因素共同促成生产工艺:温和的研磨技术,原材料不会降级;最优混合时间以及能控制湿度的公司执行高度控制的生产流程,该流程整合了所有这些因素,使培养基从小试到商业化生产实现了顺利的过渡。

作者信息:Dr. Joerg Von Hagen是默克密理博公司工艺开发部门总监。


来源:http://www.pha-china.com/article/yingdui-fenmoxing-purudongwu-xibao-peiyangji-chayi-wenti/11065



发表于 2016-2-2 21:12:10 | 显示全部楼层 |阅读模式

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该帖共收到 16 条回复!
请问:何谓 生产优质、可再生的GMP细胞培养基?
发表于 2016-2-3 15:13:10 | 显示全部楼层

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wdtd 发表于 2016-2-3 15:13
请问:何谓 生产优质、可再生的GMP细胞培养基?

感谢你对我发布文章的关注,这篇文章是分享而来。
由于这篇文章是翻译过来的,原文恐怕写的是优质的,重现性好,符合GMP条件的培养基。
发表于 2016-2-3 20:07:58 | 显示全部楼层

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读了本文,我有几点想法。

1. 本文以MEME/F12为例,用同样配方不同厂家产品培养CHO细胞,比较细胞生长密度结果,初看起来方案合理,但是在现实中,用户把在用的某一种细胞培养基,例如DMEM/F12,替换为另外厂家生产的同一种细胞培养基,往往出现一开始细胞生长不如原来,但是经过一些适应过程后,细胞就能正常生长、甚至超过以前培养基的情况。不知道本文作者的对照试验之前是否对每一个厂家的培养基进行过适应性培养?

2. 作为产品,细胞培养基最重要是质量标准,在统一的产品标准下,只有合格或不合格。而这一点恰恰的生物行业缺乏足够重视的。

3. 细胞培养基生产实施GMP管理是必要的。我在《国内细胞培养基行业往何处去》提到国内有30家细胞培养基企业,我对大部分企业的GMP管理持怀疑态度。这也是我呼吁监管部门加强管理的原因。
发表于 2016-2-3 20:42:54 | 显示全部楼层

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毋庸置疑,实施GMP管理来生产细胞培养基是必要的,合格的原料以及稳定的生产工艺等保障培养基的一致性(批间差小),
1、文中“并非如此一致”中提出“ 尽管有标准的配方,不同厂商生产的DMEM/F12粉末型培养基外观看起来大为不同,其颜色范围从白色到浅黄到粉红。”,DMEM/F12中含有酚红(酚红仅作为pH的指示剂),酚红是带红颜色的原料,假如采用直接将酚红粉碎的工艺,那培养基干粉外观就是粉红色的,除非酚红经过处理。这并不影响培养基质量。
2、细胞培养基中成分非常复杂,除了无机盐、氨基酸、葡萄糖、维生素等成分外,其中可能含有植物水解蛋白等,要对培养基组分进行定量分析是极其困难的事,请问通过哪些检测手段测试哪些组分来预测培养基性能?
发表于 2016-2-4 08:56:56 | 显示全部楼层

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能否提供Merck Millipore生产的干粉细胞培养基的质量标准,谢谢。
发表于 2016-2-4 09:02:15 | 显示全部楼层

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可以到他们主页上看到spec
来自: 微社区
发表于 2016-2-4 10:25:51 来自手机 | 显示全部楼层

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他们主页上的spec,供大家参考。
来自: 微社区
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发表于 2016-2-4 10:51:18 来自手机 | 显示全部楼层

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谢谢"afterlens"
发表于 2016-2-4 11:07:18 | 显示全部楼层

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干粉培养基的复杂成分,一定程度上类似于高级的干粉药物或者是配方奶粉。进行大数据分析,控制生产过程工艺参数和配方阈值,从而保证同一工厂下的批间差异,相信会成为趋势
来自: 微社区
发表于 2016-2-4 11:25:28 来自手机 | 显示全部楼层

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