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生物咖啡茶

      想写“膜层析”是因为听说GE生命科学要和Sartorius联合推广Sartorius的膜层析产品。由于早年与膜结缘,让我有机会接触了膜层析。所以听到这个消息,就有点按捺不住,很想为膜层析这个我曾经为之奋斗、也给我带来过甜酸苦辣的产品摇旗呐喊一下。

      过滤和层析虽同效力于纯化,但却曾是两个完全不同的领域。膜层析产品开发之初,也没有明确的市场定位。在后来的很长的一段时间里,亦被称为膜吸附(membraneadsorber),而“膜层析”(membranechromatography)被认可和被称为“膜层析”那都是很后来的事了。我当初被前辈长者引入离子交换膜产品的研发,现在回想起来,感到真是幸运。

      给过滤产品加上离子交换功能应该是始于上个世纪八十年代。当时在CUNO研发部工作的一位华裔膜专家首先将离子交换基团结合到了用于深层过滤的滤纸上,从而使得这种滤纸除了能过滤外还具备了一定的离子交换功能。尽管最初的这种离子交换滤纸的蛋白吸附量很低,但的确开创了将过滤产品与层析相结合的历史。由于当年的生物制药才刚刚起步,细胞发酵技术不很成熟;发酵液中的目标产物不仅产量低且含有较大量的宿主细胞残留物,特别是宿主细胞的染色体。这些DNA残留不仅分子量大,还很粘,给后续的层析分离增加了很多困难。而带有离子交换能力的滤器对这些宿主DNA则有较强的吸附能力,所以产品一经试用,就受到了不少用户的欢迎。这种带有离子交换能力滤器不仅为过滤厂商开发了一种新产品,也开创了将过滤与层析相结合的纯化新技术。由于第一代离子交换滤器用的是醋酸纤维滤纸,所以zeta plus这个新产品虽能去从样品中去除DNA和蛋白等杂质,但它的吸附量低而本身的溶出物却较多。所以,zeta plus 的问世虽颇有新意却没有引起太大的重视,估计当时也没人从这个新产品预测到将来过滤和层析两大技术可能的结合。

      稍后,Sartorius 的两位膜专家成功地将离子交换基团偶联到了改性醋酸纤维膜上,从而开发了Sartobind系列产品。采用改性醋酸纤维膜不仅大大地提了离子交化膜产品的质量,也为将Sartobind引入生物纯化的工艺流程奠定了良好的基础。遗憾的是,由于当时层析与过滤没什么交集,所以这种新产品被称为吸附膜,并没有揭示其在层析分离上的真正价值。由于离子交换膜对蛋白吸附和洗脱所需要的时间极短、能大大地加快纯化工艺所需的运行时间,产品一经试用还是得到了不少用户的关注。正是由于快,样品蛋白的吸附与洗脱不再是以“小时”计,而是可以以“分钟”计,使得这种新颖吸附膜产品将一些层析胶难于完成的分离纯化变为可能。速度影响效率,离子交换膜的“快”很为这个新产品赢得了相当的市场关注。需要指出的是,早期的吸附膜也还存在着一个明显的不足,就是它的蛋白吸附量较低。因为膜的比表面积通常比层析胶小,所以吸附膜的单位体积的蛋白吸附量就比传统层析胶低。也许到了对膜层析的特点较为了解的今天,人们会扬长避短、为其选择合适的应用。但在当时,不当对比将吸附膜的缺点被放大了,造成了膜蛋白吸附量低的一个成见。历史经验表明:在激烈的市场竞争中,一个新技术产品的市场开发应该从发掘该产品的最佳应用开始。遗憾的是,由于当年吸附膜产品的应用开发投入不足,主要依赖客户去摸索;在客户早已习惯了传统层析胶的情况下,吸附膜产品的优势在纯化实践中没能充分体现。多年后,当我看到某著名药厂的一位资深工艺研发人员仍在用测试层析胶柱的条件去测试膜层析产品时的感受。当然,由于当时的市场对一次性使用产品兴趣寥寥、无人问津。如果当年的一次性产品市场也如今日的火爆,简单、方便、低耗、高效的吸附膜产品很难不成为市场的翘楚。

      进入上世纪九十年代后, Pall 公司又一次开始了离子交换膜的的开发,启动了Mustang膜层析系列产品研发项目。前车之鉴、后事之师,新一代研发人员从了解和比较离子交换膜技术的长短优劣开始,对膜层析产品进行了认真地分析和新的市场定位。新的离子交换膜不再是过滤厂商的“业余爱好”和“跨界产品”,产品也不再是“吸附膜”而是“层析膜”。为了能和传统层析产品同等竞争,研发人员首先在增加层析膜蛋白吸附量上狠下功夫。经过努力,部分离子交换膜的蛋白吸附量不仅达到、甚至还超过了当时市场流行层析胶的平均水平。研发人员随之将膜层析产品重新分类,确定了主要用于纯化分离和主要用于杂质去除的两类不同的膜层析产品。由于膜结构的稳定和均一,用于纯化分离的层析膜柱(membranemodule)的分辨率极高,几乎达到甚至超过了高压液相色谱柱的水平。为此,Amgen的一位研发总监曾在深夜从日本打电话询问和确认他的分离结果。不幸的是,限于药厂生产设备运行压力,层析膜柱的柱高不能高;这个限制给层析膜柱的放大(到药厂的生产规模)带了了极大的困难。几经努力,用于纯化分离的层析膜柱最终还是没能继续。凭心而论,尽管层析膜柱没能商业化,但这款产品还是给当时的客户带来了相当大的震动。他们不仅见证了层析膜柱的速度,也见证了层析膜柱的高分辨率。随后,主要用于杂质去除的膜层析产品(membranecartridge/capsule)系列被开发推广,并完成了最终的生产级别产品的放大和整个系列产品的商业化。近年来,随着人们对膜层析技术的了解和市场对一次性产品的需求,膜层析产品渐为广大用户所接受,市场也随之慢慢地扩大了。

      相对于传统层析,膜层析产品有三大优点,1)吸附洗脱速度快,2)对生物大分子的吸附量高,和3)运行操作简单。因为都是干膜预装柱,膜层析产品也更有益于用户储藏使用和通过工艺验证。

      说到膜层析技术的应用,首当其冲的就应该是单抗纯化中的杂蛋白去除。随着单抗市场的成熟,单抗的纯化工艺流程也相对固定。尽管,单抗纯化究竟是三步还是两步还是见仁见智,但其纯化工艺包括蛋白A层析俘获(capture)及用离子交换去除杂蛋白/DNA似乎已成定论。由于FDA对单抗产品中杂蛋白残留要求以及客户对产品的纯度的期望,大多数用户还是希望采用简单高效的离子交换产品去除杂质以加快纯化过程、保证单抗质量。在这一点上,膜层析产品的特点与市场需求相当地契合。单抗样品在经过吸附(和初纯)以后,样品中的杂质含量已经很低,但一般又达不到产品的质量标准。如果使用传统层析胶柱,由于样品过柱的流速较低,为了减少运行时间,用户往往需要用很大的柱体积来处理单抗样品,会大大增加层析设备与耗材的成本。由于膜层析的产品特点是流速快、效率高,往往用一个体积很小的膜层析柱就能满足杂质去除的质量要求。特别是所需的膜层析产品体积小,与层析胶柱相比还可节省成本,是单抗纯化工艺中杂质去除的一个好选择。

      在膜层析技术问世之前,面对样品中目标产物含量度低或目标产物易失活的挑战,传统的层析胶效果一般不大好。由于新一代膜层析产品的蛋白吸附量已大大提高而又保持了其吸附洗脱速度快的特点,所以对低浓度、活性差的样品,用膜层析吸附分离效果就很好;因此,新一代的重组凝血因子的纯化生产工艺也就理所当然地选用了膜层析技术。

      近年来,基因治疗逐渐显现出了东山再起之势。回顾膜层析的发展史,人们一定会理解当年膜层析开拓者们曾有的无奈。由于层析膜的结构特点,膜层析产品对生物大分子可谓“情有独衷”,无论是病毒分离、还是核酸纯化,膜层析产品不仅吸附量高而且分离效果好。如果不是天意弄人,当年一起说不清道不明的医疗事故延迟了基因治疗的发展,膜层析产品也许早就在病毒、核酸的分离纯化中大显身手了。我本人也曾用膜柱分离过A.Virusplasmid,效果相当好,结果也曾让不少行家里手印象深刻。

      多糖类的纯化通常采用苯酚萃取和乙醇沉淀,但采用这些方法不仅效率低而且环境污染严重。用膜层析技术去除多糖样品中的杂蛋白和DNA很可能效果不错。真心期盼我们的新一代纯化人能解放思想,开发出我们自己的生物纯化技术专利。

      随着膜层析技术逐渐被市场接受,膜层析产品的种类也日益增多。除了离子交换,用户还可再市面上买到包括亲和、疏水等不同的膜层析产品。为满足用户对两步单抗纯化的探索,厂商还推出了混合膜(mix-mode)。如果用户被内毒素污染所困扰,用户也可试试一款以去除内毒素为主要应用的膜产品。

      本想长话短说,但还是拉拉杂杂地写了不少。真心希望本文多少能对读者有些帮助;措辞行文的错漏之处,恳请大家不吝指教,在这先谢了。

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发表于 2016-1-31 03:57:56 | 显示全部楼层 |阅读模式

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该帖共收到 9 条回复!
读了杨博士的文章,使我了解了膜层析的发展历史和应用。尤其是在其发展历程中,科学家不断创新的精神,以及因为历史局限而留下的遗憾,这些在当今都是值得借鉴的。
   
面向一个创新技术,应该努力发掘其优点和应用价值,而不应该因其存在的缺陷而对其否定或者简单放弃。其实,这同样需要有创新精神。
发表于 2016-1-31 10:32:05 来自手机 | 显示全部楼层

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都是过去 发表于 2016-1-31 10:32
读了杨博士的文章,使我了解了膜层析的发展历史和应用。尤其是在其发展历程中,科学家不断创新的精神,以及 ...

非常同意您的评论。任何一个创新发明都不容易、成功大都经历了千辛万苦。我总是认为新产品的成功有两个必要条件:科学理论上的合理和生产实践中的可行,一般来说二者其实缺一不可,而发展的快慢有时则还要一点运气;膜层析能发展到今天就是靠了很多人的努力。但是,任何一个产品都有长有短,合理利用极为重要,特别希望大家能深刻了解,用好膜层析产品。
发表于 2016-2-1 05:14:30 | 显示全部楼层

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非常感谢杨博士的经验分享。转了希望帮助到更多人,HCP的确是工业界头疼的大问题。
发表于 2016-2-1 08:23:34 来自手机 | 显示全部楼层

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情有独钟。最近安排一个博士和硕士从事相关研究。看了本文感觉高手林立,我们国家生物制药技术创新有希望。希望能密切合作。最近接触几位国外回来的同行,掌握技术都很精深。建议能搞一个生物技术沙龙。
发表于 2016-2-1 08:58:19 来自手机 | 显示全部楼层

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程薇 发表于 2016-2-1 08:23
非常感谢杨博士的经验分享。转了希望帮助到更多人,HCP的确是工业界头疼的大问题。 ...

谢谢您转载杨博士的文章!也希望行业内的专家们在生物咖啡茶上发表更多的技术和经验,共同促进我国生物制药行业的进步!
发表于 2016-2-1 10:20:33 | 显示全部楼层

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liaogy 发表于 2016-2-1 08:58
情有独钟。最近安排一个博士和硕士从事相关研究。看了本文感觉高手林立,我们国家生物制药技术创新有希望。 ...

谢谢您的关注!正如您所言,我国生物技术“高手林立”,现在最重要的是充分交流、各尽所能、加速行业发展。这也正是生物咖啡茶的初衷。您的关于搞一个生物技术沙龙的建议也是我们希望的,我们共同努力。
发表于 2016-2-1 10:23:46 | 显示全部楼层

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杨于京 发表于 2016-2-1 05:14
非常同意您的评论。任何一个创新发明都不容易、成功大都经历了千辛万苦。我总是认为新产品的成功有两个必 ...

是啊,供给侧,也就是供应商不仅要有创新技术的能力,还应该有帮助用户应用技术的能力。
发表于 2016-2-1 10:48:26 | 显示全部楼层

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我看到3m的新产品宣称叫膜层析,专用于hcp 和dna去除,不知效果如何,业内如何评价?是否可以代替一步层析?
发表于 2016-2-1 12:47:22 来自手机 | 显示全部楼层

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本帖最后由 杨于京 于 2016-2-1 21:10 编辑
树杏奇 发表于 2016-2-1 12:47
我看到3m的新产品宣称叫膜层析,专用于hcp 和dna去除,不知效果如何,业内如何评价?是否可以代替一步层析 ...

3M几年前买了CUNO,所以他们有生产膜层析产品的基础。在Pall的Mustang以前(包括Mustang的早期),有层析功能的膜制产品都被称为 membrane adsorber。现在,很多用户都在考虑用或正在用膜层析在新的单抗纯化工艺中代替最后一步去杂质的层析柱。尤其是对于一次性系统,膜层析的优势更大些。而用于两步单抗纯化的膜层析产品也在研发中,用的是弱因离子交换层析原理。这种产品是需要能在相对高的盐度的缓冲液中吸附HCP和DNA。但是,由于单抗、细胞、层析胶(包括不同介质的蛋白A层析胶)、缓冲液等等的不同,再加上用户对HCP和DNA残留的不同要求,所以,有的单抗工艺用两步纯化可以、也有的不太成功。
发表于 2016-2-1 13:53:43 | 显示全部楼层

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