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生物咖啡茶

本帖最后由 杨于京 于 2016-1-25 23:23 编辑

       想起聊这个题目纯属一时激动。几天前,GE生命科学在微信上发了个“滤巨人”的免费过滤培训课程的公告,而我曾在GE生命科学一起工作过的同事又在微信上提到了10多年前的往事。因为我曾对生物纯化所需的两大技术“过滤”和“层析”都有所涉及,却又常常为层析是如此的“高大上”而过滤却很不受重视不解,就随口发了几句感慨。另一位也曾是过去GE生命科学的同事调侃说“这就是当年洗脑的成果”,令我幡然醒悟。几番微信往来,让我有了为过滤写点儿东西的想法,也就成就了此文。

       应该说我对“膜”(membrane)还是颇有感情的。一方面膜是我初入生物制药行业时最先接触到的产品,另外,也是因为膜,我才有机会接触到生物纯化的两大技术,在此领域谋生发展。多数人也许会从膜只是联想到过滤,但实际上,膜在二十多年前就已被用于层析。所以,与膜结缘就使我不仅涉足了过滤,也参与了层析。鉴于此文的动因是过滤,我就还是集中聊聊与过滤有关的那些事吧。

       刚开始接触到“膜”,首先学习的是膜材质。坦率地说,大多数用户买滤器,问价钱的多、问质量的多,问膜材质的少。而恰恰就是这个不为大家所关心的膜材质却是过滤技术几十年发展的核心。膜材质不仅会直接影响到生物纯化的产率,也会影响到膜产品的使用和和清洗。滤膜最初是从滤纸发展而来的;早期滤膜与滤纸的差距也就是它们的孔径不同,滤膜较小、滤纸较大。与滤纸材质相同,早期的滤膜材质是醋酸纤维素(cellulose)。醋酸纤维素的来源是木材、最大的优势是亲水。这使得醋酸纤维膜的非特性蛋白吸附量极低。亲水材质对大多数生物纯化工艺来说是件大好事,有利于使用者提高产率、增加回收。当然,对于那些需要膜蛋白吸附量高的应用(如快速孕检之类),研发人员又创造了新材质NitrocelluloseNC),以满足市场需求。但是,醋酸纤维膜也有一个很大的缺点,就是脆、工艺加工性能不好。记得以前经常会碰到一些客户抱怨他们用的滤器质量不好、总是泄漏。深究一下,他们用的多数产品都是醋酸纤维素材质的中空纤维滤器。为了提高过滤膜的物理性能,今天生物纯化所用的膜制品大都是合成膜。现在市面上常见的尼龙、PVDFPSPES,都是合成膜的代表。相比于醋酸纤维素,合成材料的机械性能要好得多。合成膜制品通常都很结实、不易损坏,但事情总是有得有失。合成膜的材质都是疏水的,膜的非特性蛋白吸附量要比醋酸纤维膜高得多。为了减少合成膜的非特性蛋白吸附量,在过去几十年中,研发人员除了不断更新材质,就是在不断开发新的表面活性剂,以便能使合成膜更亲水。客户在选择滤器时,不妨了解一下滤器的材质,往往供应商是可以提供不同的选择的。

       聊过了膜材质,就聊聊膜孔径。用于生物纯化的滤器分微滤、超滤和纳滤。膜孔径的标注通常词不达意,一个“公称膜孔径”(nominal membrane pore size),不知坑过多少聪明人。千万不要认为供应商的膜孔径是绝对的,这个“孔径”不仅是“公称”(就是差不多的意思),各个供应商检验其“公称”膜孔径的标准也各不相同。滤膜并不是在一张不透水的膜上打同样尺寸的洞,而是滤膜上有无数个大小不一的孔;就算是同一公司不同批次的滤器,膜孔的大小、分布也有差异。当然,微滤膜制品中也有一种膜是有统一标准的,这就是除菌滤器。除菌滤器有统一标准的原因很简单,因为这个标准是FDA定的、专为除菌而立,标准必须统一。谁不遵守,根本就通不过FDA验证。记得曾有客户问我,过滤产品为啥有的标0.2微米、有的标0.22微米。我赶紧诚惶诚恐地解释:这就是个历史的误会。如果您买的是除菌滤器,重要的是“除菌级别”(sterilizing grade),厂家标0.2微米或0.22微米都没关系,有FDA的质量检验方法管着呢。如果滤器不是“除菌级别”,标0.2微米还是0.22微米还是没关系,因为这就是个“公称”。如果客户的滤器是用于保护层析柱,那您尽管放心,无论0.2微米还是0.22微米都好用,滤液都够干净,层析柱也不会堵。

       聊过了材质和孔径,再说说应用。生物纯化在各个生物公司大都有个共识:发酵罐算上游,从放罐口以后就归下游管了。所以,不管目标产物是在细胞内还是细胞外,发酵液的固液分离一般是下游纯化的第一步。一旦说到固液分离,多数人首先想到的一定是离心机。我当初也是如此,从上学进实验室的第一天就用离心机作固液分离。但事实上,尽管离心机(特别是连续流)是很多用户的首选,过滤技术确也有着离心机所不具备的优点。在发酵液的固液分离中采用过滤技术的不仅普遍,有些还是必然,取决于工艺的要求。固液分离有些可以选深层过滤(depthfiltration),有些则以选用切向流过滤(crossflow filtration)更好。深层过滤器多采用含有硅藻土的滤纸而切向流则多采用中空纤维柱(或粗滤网的膜包)。如果目标产物是留存在细胞内的(后续需要细胞破碎的),那么切向流就应该是首选而不能用深层过滤。因为在深层过滤时,细胞是留在滤纸中间的,无法回收、更无法实施细胞破碎提取目标产物。如果有切向流过滤,不仅细胞可以回收,还可以连续换液,从而不间断地进行后续的细胞破碎。

       近年来,过滤技术的另一大应用就是病毒去除。无论国内国外,无论单抗还是生物制品,FDA都对病毒去除提出了极为严格的要求。因此,除病毒滤器的市场需求也是水涨船高。尽管病毒去除的技术多种多样,但过滤技术还是被公认最可靠、最为FDA倚重的技术。FDA明确要求在单抗生产工艺中必须要包含至少一步病毒过滤。甚至在血液制品的生产中,FDA也要求加入病毒过滤,以确保受众生命安全。病毒过滤膜的孔径极小,通常是由可去除得病毒尺寸说标注的;xxxx15指得是该滤器是为去除15nm的病毒所设计的。如此类推,标-20就是去除20nm,标-50就是去除50nm,非常简单明确。由于微小病毒的实际尺寸已和单克隆抗体相差无几,所以,除病毒过滤极为不易。这也造成了除病毒滤器的价格高昂。又因为这种确保生物制品安全的产品都是一次性使用,就成本而言,病毒过滤器已成为用户的一大负担;再加上过滤中可能的目标蛋白损失,用户真心需要下功夫去研究、优化工艺参数以求提高效率、节约成本。

       最后想聊的就是前面提到过的“超滤”(ultrafiltration)。中文“超滤”这个词儿在过滤技术领域可算是个“异类”。不光“超”字于滤膜的孔径无关(超滤膜的孔径是纳米级的),也与其运行方式无关(超滤的运行方式是切向流)。更令人迷惑的是切向流过滤工艺中还有一种特定方法也叫超滤,所以揭示起来有时着实让人挠头。超滤膜孔径的标注用的不是长度单位,和除病毒滤器类似,超滤膜的孔径是由其设计截留的蛋白分子量(molecularweight cut off MWCO)来标注的。“继承”滤膜孔经标注的传统,细心的客户还会发现:不同厂家生产的有同样MWCO的超滤膜不仅膜孔的检验方法和标准不同,其在实际使用中的表现也不同。这事不仅说着拗口,在实际应用中更令人困惑;但无论拗口也好、 困惑也罢,事实就是如此。但虽然超滤产品各自为政,其在纯化工艺中扮演的角色却极其重要。不仅单抗浓缩多用超滤,病毒纯化中用超滤更是好处多多。在这,我特想提醒用户两件事:因为超滤浓缩往往都是在纯化工艺的最后,而这时客户目标产品的浓度又相当高,任何一点损失都是纯化初期任何一步都难于比拟的、相当可观的。但是,在实践中我又多次看到研发工程师为了提高捕获(capture)层析柱1%的回收率而绞尽脑汁,却对最后一步的超滤浓缩的工艺优化掉以轻心。再有就是超滤在病毒(特别是人苗和兽苗)纯化中应用。在疫苗的生产中,疫苗的副作用(sideeffects)多是由宿主细胞残留和宿主蛋白残留所造成的,这些副作用又往往是推广疫苗一大障碍。我就清楚地记得小时候接种疫苗发烧的情景,也听到过兽医需要保护才能为农户家畜接种疫苗的传闻。理论和实践都证明了,如果客户将超滤技术(多为中空纤维)运用于疫苗生产之中,对疫苗的质量的提高不仅有效而且经济(高质量的疫苗的市场价格远高于低质量的疫苗)。

       这篇小文聊到了与过滤有关,但又常被人们忽视的一些问题。应该说,过滤技术既简单又复杂,用好了利国利民、利人利己,很值得大家重视。不觉间拉拉杂杂写了这么多,但如果本文中所聊到的能为正在或将要使用过滤技术的人提供到些许帮助,我就颇感荣幸了。还是照以前说过的,本文中如有谬误,敬请有识之士批评指正,在这就先谢了。

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发表于 2016-1-24 01:24:55 | 显示全部楼层 |阅读模式

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该帖共收到 32 条回复!
您把过滤讲得很透彻,深入浅出。能不能介绍一下过滤在兽用疫苗纯化中的应用?
发表于 2016-1-24 21:19:20 | 显示全部楼层

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都是过去 发表于 2016-1-24 21:19
您把过滤讲得很透彻,深入浅出。能不能介绍一下过滤在兽用疫苗纯化中的应用? ...

谢谢鼓励。写这个小文颇有点“忆往昔峥嵘岁月稠“的意思,但既然您问到”过滤在兽苗中的应用“,我就尽力说点。因为我接触兽苗不多,只能是以有限的经历和了解,斗胆说点我的看法,算抛砖引玉吧。

这几年,做单抗得多,谈疫苗的少。然而,生物制品不仅重要而且市场价值很高。一个疫苗有几亿、甚至几十亿的销售不鲜见。但是,由于疫苗产品源远流长,而生物制品的传统是不坏不修(don't fix it if not broken),所以,主动改进的情况不多,而且这事国中外的状态都差不多。我在访问国外疫苗生产厂商及和在他们交流讨论时,也常常看到用了几十年的老工艺、听到不愿改进的说法。但是,事情总是要与时俱进的。随着FDA、EMEA对生物制品质量要求的提高,新的工艺、手段不断被采用。由于过滤技术 简单易行,运营成本低 、效果好;大多数的时候都是最先被采用的技术。记得多年前,因为EMEA对兽苗质量要求的提高(主要是要去除宿主细胞杂质),欧洲一些厂家主动和我们联系,求我们帮他们用中空纤维做超滤用于以改进工艺。尽管,我也曾听到老技术人员的抱怨,但大势所趋,动物疫苗纯化中采用过滤、超滤技术的也越来越普遍。

疫苗的生物成分主要是病毒、蛋白、多糖等,以病毒居多。如果用细胞培养,无论需不需要细胞破碎,去除细胞和细胞碎片都是必需的。如我的小文中所说,离心机固有它的长处,但过滤自有它的特点。特别是固液分离后如果需要细胞破碎(一般这时都还需要换液),那么,用切向流过滤就很有优势,而且,整个工艺还可以在封闭的条件下连续进行。

在目前疫苗质量要求中最具挑战性的一条就是宿主蛋白的去除。单抗的质量要求已经达到了百pg级,而有的客户为了安全起见,已做到了低于几十pg。记得CFDA对人用狂犬杂蛋白的去除也到了pg级,这曾使不少生产厂商难以应付。实际上,大孔径超滤技术在去除病毒苗宿主杂蛋白上可以大显身手。

另外,DNA苗、蛋白苗都有浓缩提纯的要求。MSD的一款DNA苗就是用了中空超滤技术从而使产品质量大幅提高并有效地控制了生产成本而顺利上市的。

当然,在一个传统工艺中引用新技术一定会面临技术和成本的双重挑战。但是,只要用户下决心实施,现代技术是可以应对这些挑战的。实践证明,高质量的产品在经济上的回报往往要高于投入。记得有做兽苗的朋友曾经过告诉过我,尽管一些进口兽苗价格不菲,但却供不应求;因为市场价格是对应产品质量的。

拉拉杂杂有些了不少,希望对读者能有些帮助。谬误之处、敬请指正。
发表于 2016-1-24 23:15:37 | 显示全部楼层

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谢谢杨博士的介绍!也希望杨博士讲的这些对疫苗行业的同仁有启发意义。
发表于 2016-1-25 08:12:30 来自手机 | 显示全部楼层

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为什么除菌级的滤膜最初标称0.22um,那是有个传说的,简而言之,就是0.45um除以2,只保留2位小数。主要是因为FDA先定下检测无菌的滤膜孔径为0.45um,后来才定义除菌级滤膜为0.22um。
发表于 2016-1-25 08:14:21 来自手机 | 显示全部楼层

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本帖最后由 杨于京 于 2016-1-25 08:39 编辑
吴健 发表于 2016-1-25 08:14
为什么除菌级的滤膜最初标称0.22um,那是有个传说的,简而言之,就是0.45um除以2,只保留2位小数。主要是因 ...

受教了。学过最初除菌过滤是0.45um,也学过由于发现有些饥饿细菌能透过0.45um的滤膜,所以FDA用了新的挑战细菌而除菌膜的“公称”孔径也降到了0.22um或0.2um。这个传说有意思,更证明了标注过滤膜孔径必须用“公称”。
发表于 2016-1-25 08:37:59 | 显示全部楼层

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杨老师好!您刚谈到膜的材质种类及使用特点,想请教一个问题,过滤膜在制造过程中使用粘合剂有那几种?氯仿对不同材质的膜的过滤效果有何影响?
发表于 2016-1-25 08:55:46 来自手机 | 显示全部楼层

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张总现在下游纯化也涉猎很深啊
发表于 2016-1-25 09:23:24 来自手机 | 显示全部楼层

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Afterlens 发表于 2016-1-25 09:23
张总现在下游纯化也涉猎很深啊

柱子哥,这个可是着实不敢当啊!我不过是弄一个地方请你们这些专家来分享经验。
发表于 2016-1-25 09:42:41 来自手机 | 显示全部楼层

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杨博士太客气了,这个传说是在Millipore内部老一代搞检测的同仁中的传承。如有兴趣,可以另文探讨。
发表于 2016-1-25 09:56:28 来自手机 | 显示全部楼层

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