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生物工艺行业(六)层析

张韧

一、层析技术的发展

1.层析的概念

Chromatography,层析或色谱,是利用样品中不同成分的理化性质差异(如吸附力、分子极性、分子形状和大小、分子亲和力、分配的系数等)将样品分离的一种现代分离纯化技术。样品内各种成分会在Chromatography的固定相与流动相中分布不同,并随着流动相延着Chromatography Media(胶、填料、介质)以不同速度移动,从而达到分离的目的。

按其应用领域的不同,Chromatography曾被翻译为层析、色谱、色谱分析等。在样品量小而精度要求高的实验室和质量检测中,Chromatography通常被称为色谱,更确切英文应是Analytical Chromatography。而在样品量大而精度要求不那么高的生产工艺(特别是生物大分子分离工艺)中所用的Chromatography,虽然与色谱原理相同,但却通常会被称为层析,所对应的英文一般是Process Chromatography。虽然源于同一发明,但因其目的用途不同、使用的仪器设备不同、工艺方法着重点不同,其对应的Chromatography Media也有很大不同。在一些跨国公司中,层析(工艺)和色谱(分析)一般会分在两个不同的业务部门。在国内教科书上Chromatography往往统称为色谱分离,但在生产实践中、特别是大分子生物制药行业中,层析还是被广泛使用的一个词。

本文则主要介绍主要在生物制药纯化工艺中使用的层析技术。

2.层析/色谱的发展

层析/色谱,是俄国植物学家Michael Tswett在1903-1906年间发现并命名的。他利用吸附原理成功地将叶绿素在滤纸上分离,得到不同色带、即色谱图,并将这种方法命名为Chromatography。

自20世纪40年代起,层析技术不断发展,相继出现气相色谱(以气体为流动相)、液相色谱(以液体为流动相)、高压液相色谱(流动相压力超过3000psi)、薄层色谱(以玻璃板表面涂层为固定相)、亲和色谱(固定相带有特定吸附基团)、凝胶色谱(流动相内成分以分子量大小影响其流过固定相的时间)等。1952年,英国科学家Martin和Synge因发明分配色谱分离法获得诺贝尔化学奖。色谱分析方法还在12项获得诺贝尔化学奖的研究工作中起到关键作用。

1954年,担任瑞典法玛西亚公司(Pharmacia,思拓凡(Cytiva)的前身)葡聚糖研发负责人的诺贝尔化学奖获得者Tiselius及其团队发现了交联葡聚糖颗粒可以分离水溶性分子,1959年法玛西亚推出全新产品Sephadex(Sephadex取自Separation、Pharmacia和Dextran三个单词的第一个字节),Tiselius为这种新型介质取名凝胶过滤介质。

20世纪70年代,美国Waters公司推出世界上第一台商品化高效(压)液相色谱仪HPLC(High Performance/Pressure Liquid Chromatography)。HPLC很快成为在有机化学、生物化学、医学、药物开发与检测、化工、食品科学、环境监测、商检和法检等方面最为常用的分离和检测手段。

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图6.1 高效(压)液相色谱仪HPLC。
图片由汉邦科技提供。

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图6.2 UniSil硅胶色谱分析柱。
图片由纳微科技提供。

20世纪60、70年代是色谱/层析技术快速发展的时代,各种人工合成的介质如硅胶、聚苯乙烯二乙烯基树脂、琼脂糖、葡聚糖、聚丙烯酰胺等树脂或凝胶陆续出现,极大地拓展了层析技术的应用领域和范围。基于不同介质层析方法的发展也如雨后春笋般不断涌现,层析分离技术也开始用于化工行业(其使用的Chromatography Media通常被译为树脂)的生产中。

作为功能强大的纯化工具,层析技术被广泛应用于很多行业。层析分离也从分离小分子化工产品延伸至分离大分子的生物制药工业领域。日益发展的层析分离技术能够满足对蛋白质、病毒、核酸等大分子生物产物的分离纯化需求,柱层析也逐渐成为生物药品生产厂家下游生产工艺过程中最常用的纯化方法。生物制药产业中可采用层析分离纯化方法包括亲和、离子交换、疏水作用以及金属螯合和凝胶过滤等多种。至今,大规模生物制药下游分离纯化生产中所使用的层析柱直径已经可以达到两米以上。

从上个世纪80年代起,生物制药迅猛发展,层析成为新一代生物制药纯化的重要工具,生物制药下游工艺技术从此形成。

3.层析分离纯化与色谱分析的区别

虽然层析与色谱原理相同,但不同的应用领域导致二者存在很大的差异。

1)用途和处理量不同
层析用于大规模生产的分离和纯化,所需处理的样品批量大,通常kg级或更大;色谱多用于样品定性、纯度检测,所需处理的样品量小,一般µg级或更小。
2)压力不同
层析柱一般为中低压(小于60psi);色谱柱压力较高(可超过3500psi)。
3)填料不同
层析柱填料粒径较大;色谱柱粒径较小。
4)分离精度要求不同
层析注重效率、回收率等指标;色谱注重精度和纯度等指标。

纳微科技的微球精准制造技术对微球的材料组成、粒径大小、粒径均匀性、孔径大小及表面性能够实现精准调控。借助这一技术平台,纳微科技开发出系列高性能单分散色谱填料和层析介质可以满足实验室色谱分析检测到工业纯化的需求。产品涵盖硅胶色谱填料、手性色谱填料、及以聚合物为基质的离子交换、疏水、Protein A亲和层析介质等。


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图6.3 各种粒径的单分散聚合物填料。
图片由纳微科技提供。

二、层析技术的分类和应用

1.按照功能分类和应用

1)凝胶过滤层析
凝胶过滤层析,Gel Filtration Chromatography,又称排阻层析或分子筛层析,是根据分子大小和形状的差异进行分离的一种简单可靠的层析技术。
凝胶层析介质主要有葡聚糖凝胶层析介质、琼脂糖凝胶层析介质、聚丙烯酰胺凝胶层析介质、琼脂糖-聚丙烯酰胺混合凝胶层析介质、多孔硅胶等。
凝胶过滤层析分辨率高,多用于精纯,主要用于蛋白质、多肽、脂质、抗生素、糖类、核酸及病毒等分离纯化,脱盐等。

2)亲和层析
亲和层析,Affinity Chromatography,是根据流动相中的生物大分子与固定相表面偶联的特异性配基发生亲和作用,并选择性吸附溶液中的溶质而进行分离的方法。
亲和层析介质由载体加配基和活化剂组成。主要载体有纤维素、葡聚糖、琼脂糖、交联琼脂糖、聚丙烯酰胺、多孔玻璃等;配基有有机小分子类、生物大分子类和染料类等。

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图6.4 UniMab Protein A亲和层析介质。
图片由纳微科技提供。

金属螯合亲和层析,Metal Chelating Affinity Chromatography,是利用固定相偶联的配基—亚胺基乙二酸钠与二价金属离子发生螯合作用,该金属离子又与蛋白质分子中的某些含有巯基或咪唑基的氨基酸结合这种特性进行层析分离的方法。

金属螯合层析介质通常以琼脂糖珠为载体,以亚胺基二乙酸钠为配基,通过活化偶联而成。二价金属离子有Cu2+、Zn2+、Ni2+、Mn2+、Cd2+、Co2+等,以金属盐的形式存在。

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图6.5 金属鳌合层析介质预装柱。
图片由纳微科技提供。

亲和层析具有分辨率较高、交换容量较大、高流速的特点,多用于初分离和中间纯化阶段,主要用于蛋白质、激素、酶、核酸、病毒、抗原等的分离纯化。

3)离子交换层析
离子交换层析,Ion Exchange Chromatography,是一种吸附层析。根据带电荷的分子和层析填料上相反电荷之间可逆的相互作用进行分离。离子交换层析是基于分子之间电荷的差异进行分离。

离子交换层析介质由惰性载体加活性交换基团组成。载体为高分子化合物聚合而成或多糖类化合物交联而成的球形颗粒,主要有纤维素、葡聚糖、琼脂糖、聚苯乙烯树脂、聚乙烯醇等;交换基团由容易解离的酸性基团或碱性基团组成。

纳微科技的NanoGel离子交换层析介质采用利于传质的单分散超大孔聚合物基质以及独特的表面延展技术,具有高流速、低反压、高分辨率、高载量等层析性能优势。
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图6.6 NanoGel离子交换层析介质(左)和预装柱(右)。
图片由纳微科技提供。

离子交换层析技术具有分辨率高、交换容量大、高流速的特点,应用广泛,是蛋白质、多肽和核酸等生物产物的主要纯化方法。

4)疏水层析
疏水层析,Hydrophobic Chromatography,也叫疏水相互作用层析,是一种液相吸附层析,它是依据生物分子之间的疏水性的差别来进行分离的。
疏水层析介质由各种凝胶过滤介质偶联疏水性配基组成,常用疏水性配基有苯基、短链烷基(C3-C8)、烷氨基、聚乙二醇和聚醚等。
疏水层析基于疏水性分离纯化蛋白质类生物大分子,具有分辨率较高、交换容量较大、高流速的特点,多用于中间阶段纯化,在初分离中也有一定应用。

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图6.7 左为疏水层析介质,右为预装柱。
图片由纳微科技提供。

2.按照层析产品分类和应用

1)柱层析
柱层析,Column Chromatography,技术采用由层析介质装填成柱、用于纯化分离,而生产使用的层析填料的直径可以从15µm至200µm以上。层析柱在装填以后需要测柱效,以保证层析柱的质量、防止泄漏。由于层析柱由层析介质装填而成,所以层析柱体积大小可以依层析设备增减。层析柱通常在生产现场装填,其装填质量与操作人的素质和经验相关,为解决装柱困难,近年来不少公司提供自动装柱设备以帮助客户更好地使用层析技术。

整体柱,Monoliths Column。为了提高生产效率、增加层析介质对病毒DNA等超大生物分子的载量,自上个世纪90年代起,一些公司开发出整体柱。整体柱是将预聚合液引入柱管中使其在适当条件下进行原位聚合或固化,最终形成多孔的整体结构,材料表面可以根据需要作相应的功能处理。但由于聚合过程的工艺问题,使得整体柱的体积受到局限。BIA Separations公司将柱改成管状后,整体柱做到8L,但整体柱在实际生产中的应用比较少。

柱层析是目前生物制药生产工艺中应用最为广泛的技术之一,特别是在单抗的纯化工艺中,柱层析被广泛应用于捕获和初纯两步以及精纯。

2)膜层析
膜层析,Membrane Chromatography,是过滤与层析结合的纯化技术。20世纪80年代,美国CUNO公司将离子交换基团结合到深层过滤的滤纸上,得到具备一定离子交换功能的滤纸,开创了过滤产品与层析技术相结合的历史,也为过滤厂商开发出一类新产品。

随后,Sartorius公司成功将离子交换基团偶联到改性醋酸纤维膜上,大幅度提高了离子交换膜产品的质量,为这类产品应用于生物纯化工艺奠定了良好的基础。

到了本世纪初,PALL公司研发出蛋白吸附量更高的层析膜,部分离子交换膜的蛋白吸附量达到甚至超过当时层析胶的水平。膜层析产品逐渐被市场所接受。

膜层析技术主要用于对工艺过程中污染物的有效去除,对超大分子物质(病毒、质粒等)的纯化,以及对层析柱和除病毒过滤器的保护。

相对于传统层析,膜层析产品吸附洗脱速度快,对生物大分子的吸附量高,运行操作简单。此外,因为都是干膜预装柱,膜层析产品也更便于用户储藏使用和通过工艺验证。
纳米纤维,Nanofiber,因其具有高比表面积的特点而被视作新一代膜层析基质的重点研究对象。

膜层析产品也包括离子交换、疏水、亲和等化学基团,主要用于超大生物分子(病毒、质粒等)的捕获。近年来,在单抗纯化中,膜层析产品被越来越多地用于精纯(DNA和杂蛋白去除)。对于浓度低、活性差的样品分离纯化,膜层析也体现了其特有的分离纯化速度快的特点。

3.按照纯化工艺分类

1)批次层析
批次层析是传统工艺,一个批次使用一根柱子完成上样、洗脱、清洗的循环。

2)连续流层析技术
连续流层析,Continuous Chromatography,指将多个层析柱串联进行层析纯化的方法。通过多柱位设计,实现上样、洗脱和后处理的自动化连续运行。

下图是三根层析柱组成的连续流层析示意,每个上样过程包含两根串联的层析柱,以保证前上样柱在达到一定的样品流穿水平后及上样后冲洗过程中,流穿样品完全被后一根层析柱吸附,非上样层析柱同时执行洗脱、清洗、及平衡过程。

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图6.8 连续流柱层析示意图。

连续流层析技术能够以较小规模的设备实现较高的产能,降低填料和缓冲液等耗材成本,大幅度缩短工艺时间、提高生产效率,同时节省了场地。另外,连续流层析技术极其适合上游灌流培养工艺,以及不稳定目标产物的纯化。

为了有效地降低生产成本,提高厂房利用率,越来越多的生物制药巨头已转向连续生物生产工艺。包括美国食品药品监督管理局(FDA),欧洲药品管理局(EMA),日本药品医疗器械管理局(PMDA)在内的法规监管部门开始更多关注连续制造工艺并鼓励制药企业用更有效的制药工艺来生产更安全、更稳定、更经济的药物。早在2017年,FDA就发布了连续制造(Continuous Manufacturing)的意见征求稿;2019年2月26日,FDA颁布了连续制造的质量指南草案,对于连续制造的法规指导做了进一步说明。

连续生产工艺是生物制药生产的发展趋势。连续流层析因其在节约填料成本方面的独特优势,受到生物制药行业高度关注。跨国公司思拓凡、默克、颇尔等都已经开始推广连续流层析技术和产品;在国内企业中,汉邦科技有望不久填补国产产品的空白。连续层析需要的高流速、多柱子工艺条件对层析介质的机械强度和性能也提出新的要求,粒径均一的单分散层析介质在连续层析分离纯化工艺中应该具有一定优势。

4.按照层析设备分类

1)手动层析柱
手动旋转螺杆调节柱头高度进行装填,具有操作简单,方便易用,易于维护的特点。
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图6.9 小试及中试手动层析柱。
图片由汉邦科技提供。

2)自动层析柱
自动装柱方式保证毎次装填效果一致性以及层析结果的可重复,可降低生产过程中装填效果批间差异所带来的风险,避免对操作者的人为依赖。
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图6.10 中试及生产级自动层析柱。
图片由汉邦科技提供。
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图6.11 自动喷胶层析柱。
图片由汉邦科技提供。


3)层析系统
全自动层析系统可以通过手动或自动进行平衡、上样、冲洗、洗脱、自动收集、在线清洗(CIP)等工艺过程。

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图6.12 实验室层析系统。
图片由汉邦科技提供。

5.减少纯化步骤的发展

生物制药生产的下游纯化过程相对复杂和精细,通常需要经过固液分离、捕获、初纯、精纯、除病毒、除菌等过程。减少纯化步骤可以提高效率、提高回收率。

1)扩张床吸附
扩张床吸附,EBA(Expanded Bed Adsorption),与前述固定床柱层析相比,扩张床具有较高的空隙率,可以允许料液中细胞、细胞碎片等固体颗粒的通过,且吸附剂的利用率高,分离效率高。作为蛋白质的初步分离方法,能够取代固液分离、浓缩和初纯等几个步骤,提高效率、提高回收率。但该技术对于料液以及工艺细节有一定要求。思拓凡(Cytiva)等公司有扩张床吸附的填料产品。

2)磁性吸附剂
磁性吸附剂(Magnetic Bead),也叫磁珠,大多是在聚合物吸附剂中心包裹纳米级的Fe3O4,使用与传统的层析树脂相同的吸附原理和配基,捕获目标后用磁力将悬浊液分离,然后冲洗和洗脱,同样将固液分离、浓缩和初纯等几个步骤整合为一。

磁珠最初用于实验室分离纯化DNA,有多家公司拥有用于实验室的磁珠产品,如Bioclone, Roche, Thermo Fisher, BD Biosciences, Chemagen等。然而磁珠价格、工艺放大规模、磁珠重复使用次数及配套设备是该技术用于生物制药生产需要解决的问题。

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图6.13 磁性琼脂糖微球(蛋白纯化磁珠)。
图片由纳微科技提供。

三、层析有关的法规和标准

1. 中国国家标准
中华人民共和国国家标准《金属螯合层析介质(GB/T 38171-2019)》、中华人民共和国国家标准《蛋白A亲和层析介质(GB/T 38172-2019)》、中华人民共和国国家标准《高效液相色谱仪(GB/T 26792-2011)》。
2. GMP规定
新版GMP附录3,生物制品第五十条:不同产品的纯化应当分别使用专用的层析分离柱。不同批次之间,应当对层析分离柱进行清洁或灭菌。不得将同一层析分离柱用于生产的不同阶段。应当明确规定层析分离柱的合格标准、清洁或灭菌方法及使用寿命。层析分离柱的保存和再生应当经过验证。
3. PDA Journal
PDA Journal of Pharmaceutical Science and Technology(2008) Validation of Column-Based Chromatography Processes for the Purification of Proteins。

四、层析业务的跨国公司(排名不分先后)

1)思拓凡(Cytiva)
2)赛多利斯(Sartorius)
3)德国默克(Merck)
4)赛默飞世尔(Thermo  Fisher)
5)东曹(TOSOH) 日本公司。
6)3M
7)颇尔(PALL)
8)伯乐(BioRad)美国公司。
9)诺华赛(Novasep)
10)ChromaCon瑞士公司
11)BIA  Separations斯洛文尼亚公司。

五、一次性层析系统

一次性层析技术同样发展很快,大多数层析业务相关跨国公司都推出各种一次性层析产品。

1. 一次性层析柱
1)德国默克(Merck)2)BIA        Separations斯洛文尼亚公司。
3)赛默飞世尔(Thermo        Fisher)
4)瑞普利金(Repligen)
5)思拓凡(Cytiva)
6)伯乐(Bio-Rad)

2. 一次性膜层析
1)德国默克(Merck)
2)颇尔(PALL)
3)思拓凡(Cytiva)
4)赛多利斯(Sartorius)

3. 一次性层析系统流路
1)思拓凡(Cytiva)
2)德国默克(Merck)

4. 一次性层析系统
1)思拓凡(Cytiva)
2)赛多利斯(Sartorius)
3)德国默克(Merck)

汉邦科技在国内首家推出一次性层析系统和超滤系统。一次性系统的所有接液材质均为一次性可更换部件,尤其适合多产品共线的药品生产企业和CMO/CDMO用户。

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图6.14一次性层析系统。
图片由汉邦科技提供。

六、国内层析技术的发展与思考

1. 国内层析行业的发展

我国自20世纪60年初开始研究色谱分析、研制色谱分析仪,已经有超过百家相关企业。但是作为生物制药纯化的层析技术,还是在21世纪后才起步的。到现在,已经涌现出一些层析介质和设备企业,在介质材料研发和制造工艺等方面也取得可圈可点的进步,有的企业也加入纳米纤维膜层析基质的研发行列。不过与跨国公司相比,在产品技术、种类和应用方面还存在差距,而且层析设备企业与层析填料企业往往相互独立。

据不完全统计,国内层析业务企业有(排名不分先后):纳微、博格隆、汉邦、利穗、汇研、中科森辉、千纯、华纯、保赛恒成、蓝晓、逗点、月旭、华创精科、荣捷、慧德易、迈思通、新辉、德兰梅勒、欣赛、加莱克、佰纯润宇、依利特、赛谱仪器、科众源创、东富龙、奥星等。

上述层析业务企业中,有的源于色谱业务,有的专做填料业务。有一些制药设备集成或工程公司把层析设备作为其工程项目的一部分,如东富龙、奥星。而汉邦科技等一些层析设备企业也向用户提供层析系统、层析柱、稀释配液、超滤、储罐、管路的下游纯化整体解决方案。

2. 对国内层析行业的思考与建议

经过十几年发展,国内企业在层析填料和设备方面的产品已经在生物制药行业得到一些应用,但与跨国公司还有不小差距。

1)重视色谱与层析的区别
有一部分企业是色谱分析业务发展而来,对生物制药技术缺乏足够的了解,所以产品的性能和技术与生物制药工艺需求存在差距。

2)重视纯化工艺开发与技术支持
纯化工艺千变万化,层析企业应该具备为用户开发个性化纯化工艺的能力,并为用户提供好技术支持与培训。连续层析工艺的开发也应该受到重视。

3)提高验证能力
验证是生物医药纯化工艺的关键环节,一定要建立企业的验证技术能力,能够为用户提供符合法规要求的工艺验证文件和服务。

例如汉邦科技建立了专业的验证体系,以保证设备符合国内外制药行业相关法规要求,并可为客户提供全套验证文件与验证服务。

4)整合层析填料与层析设备业务
与细胞培养基和生物反应器的相互关系相比,在生物下游工艺开发应用中,层析填料与层析设备的关联性和依赖性非常强,二者业务整合有利于提高产品性能,有利于为用户提供更好的整体解决方案和技术服务,也提高企业自身市场竞争能力。

5)开发膜层析产品
过滤技术与层析技术结合的膜层析技术具有独特应用优势,也带来市场需求空间,对于过滤企业和层析企业都是业务发展机会。

6)开发一次性层析产品
跟随生物工艺发展,开发一次性过层析产品系统和连续层析系统。

7)开拓国际市场
已经有层析相关产品出口业务发生,通过提高产品的技术水平,尤其是工艺性能和支持能力,进一步扩大出口业务。


下期预告:第六部分CDMO


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发表于 2021-1-20 20:54:09 | 显示全部楼层 |阅读模式

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