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生物咖啡茶

生物工艺行业(三)生物反应器

张韧


一、生物反应器的分类与应用
随着细胞培养技术的发展和应用,大规模培养技术越来越受到重视,而该技术的最主要设备就是生物反应器(Bioreactor)。生物反应器是指以活细胞或酶为生物催化剂进行细胞增殖或生化反应提供适宜环境的设备,它是生物反应过程中的关键设备。

1962年,Capstick等人实现了BHK21细胞的悬浮培养,这是动物细胞在工业化应用中的突破性进展,其连同传代细胞系的建立,共同驱动了动物细胞大规模工业生产进程的发展。1967年,Van Wezel首次在葡聚糖凝胶颗粒DEAE Sephadex上实现了贴壁细胞在生物反应器中的大规模培养。悬浮培养与微载体培养技术的成功开发标志着动物细胞大规模培养技术的开始。在20世纪60年代以来,动物细胞培养用生物反应器有了很大发展。

早期生物反应器的设计理念主要是建立在微生物发酵用搅拌式生物反应器基础上的。搅拌式生物反应器是开发较早,也是在研发和生产中应用最为广泛的一类生物反应器。到80年代以后,为克服搅拌式生物反应器对动物细胞产生的剪切力问题,许多低剪切力的生物反应器被设计出来,例如笼式搅拌生物反应器、固定床生物反应器、中空纤维生物反应器、流化床生物反应器、气升式生物反应器、波浪式生物反应器等。

1.搅拌式生物反应器
搅拌式生物反应器,Stirred-tank Bioreactor,是开发较早也是在研究、中试和生产中应用最为广泛的一类生物反应器,主要由培养罐、管路、阀、泵、马达及仪器组成。搅拌式生物反应器通常由马达带动桨叶混合培养液,利用搅拌器(Impeller)的旋转驱动细胞培养液流动混合,使细胞和养份在培养液中均匀分布的反应器。目前根据搅拌器结构的不同,可将搅拌式生物反应器分为机械搅拌式、笼式通气搅拌式、海船式搅拌式、旋转滤器结合推进式及离心式搅拌式等。

搅拌式生物反应器的罐体材质有所不同,小型生物反应器罐体通常采用硅硼酸盐玻璃制作,可以在高压灭菌器内进行灭菌,用于实验室规模的研究;大型生物反应器罐体采用不锈钢材质,灭菌方式采用高压蒸汽在线灭菌,常用于中试及大规模生产。罐体上安装的不同传感器在线持续检测细胞培养液的pH、温度、溶氧、葡萄糖消耗、氨积累等参数。
搅拌式生物反应器的优点是能够培养各种类型的动物细胞,且培养工艺容易放大,是工厂化生产的主流生物反应器,最大体积达到25000L。

搅拌式反应器也是一次性生物反应器中使用最多的类型。
图3.1经典搅拌式生物反应器。
图片由Eppendorf公司提供。

2.波浪式生物反应器
波浪式生物反应器,是一种一次性生物反应器,通过摇动板带动细胞袋内的培养基产生波浪促进营养物质的交换和氧气的传递,剪切力小,细胞袋一次性使用,无需清洗和验证。

波浪式生物反应器比较适合全悬浮细胞培养、连续培养,但其工作体积不宜过大。

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图3.2波浪式生物反应器示意图
3.固定床生物反应器
固定床生物反应器,Packed-bed Bioreactor,也称填充床生物反应器、篮式生物反应器,罐体中的篮子用于填充细胞贴壁的纤维片状载体,具有很高的表面积与体积比,可以得到较高的细胞密度,适用于高产量分泌性产品的悬浮或贴壁细胞及连续培养。结合了搅拌式反应器和细胞固定技术的优点,细胞在片状载体内部生长,不与搅拌桨及气泡直接接触,使得搅拌剪切力和气泡对细胞的损伤可忽略不计。一般细胞在固定床生物反应器上密度可达2.5x107个/ml以上。目前在国内重组蛋白药物治疗如EPO和多种疫苗领域有很成功的应用。


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图片由Eppendorf公司提供。图3.3固定床生物反应器。

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图3.4固定床生物反应器的篮式搅拌桨及片状载体
图片由Eppendorf公司提供。

4.中空纤维生物反应器
中空纤维生物反应器,Hollow Fiber Bioreactor,是利用中空纤维筒作为培养容器的生物反应器,中空纤维筒与细胞培养基储液瓶、双向泵通过导管连接,构成连续流动的封闭培养系统。细胞培养基从中空纤维内部流过,可以自由透过纤维,供给在中空纤维外生长的细胞。

中空纤维生物反应器适合于培养贴壁细胞、悬浮细胞,适合于连续流培养,缺点是培养体积较小。适用于小产量产品生产和细胞治疗。

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图3.5中空纤维生物反应器示意图



2000年以后,随着单抗药物的兴起,工业化动物细胞培养用生物反应器生产工艺进一步成熟,规模趋向大型化和简单化。最大的生物反应器已达25000L,主要是便于放大的机械搅拌式生物反应器。近年来,制药一次性系统发展很快,各种类型的一次性生物反应器也随之快速发展。

另一方面,工艺开发和细胞培养基研发用的最小的生物反应器为10-15mL。这些模拟大规模培养的迷你生物反应器被用于缩小规模(Scale-down)实验,以较小的代价确定大反应器的最佳工艺条件。

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图3.6 DASbox高通量迷你生物反应器。图片由Eppendorf公司提供。


二、生物反应器细胞培养工艺
生物反应器培养细胞主要有3种工艺:批培养、流加培养和灌流培养。

1.批培养

批培养(Batch culture),指在反应器中一次性加入培养基和接入细胞种子,在培养过程中除了调节培养环境的温度、pH和溶氧外,不补充培养基也不排出培养基直至培养过程结束。
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图3.7批培养

2.流加培养

流加培养(Fed-batch culture),也称补料分批培养,指培养基根据细胞生长代谢的情况逐渐补加,维持葡萄糖、谷氨酰胺等营养物在合适的浓度,降低代谢副产物的产生,避免出现关键营养物被耗尽,从而达到延长培养时间、提高细胞密度的效果。
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图3.8流加培养

3.灌流培养

灌流培养(Perfusion culture),指细胞培养过程中不断添加培养基补料,同时通过细胞截留滤器排出培养液的废液和产物收获液,而活细胞被截留在反应器中的一种操作方式。

新兴的连续培养工艺主要是采用灌流培养工艺,同时在灌流速率、培养基补料成分等方面进行优化,以实现高密度、高表达的工艺效果,从而减小培养体积和场地空间,提高产量,降低成本。

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图3.9灌流培养

全悬浮培养的细胞可以直接在生物反应器中进行培养,而贴壁细胞往往需要借助微载体等载体才能在生物反应器中培养。

在生产过程中还需要经过生物反应器的放大工艺,以实现对产量规模需求。也就是细胞从较小体积生物反应器培养到更大体积生物反应器中培养的过程。

全悬浮培养的细胞可直接实现从小体积生物反应器向大体积生物反应器的放大;微载体培养则需要将载体上的细胞消化下来,再接种到下一级更大的生物反应器中培养,以实现反应器与反应器间的放大。

细胞培养工艺过程的放大一直是生产中需要解决的问题,因为生物反应器几何尺寸的放大带来的不仅仅是培养体积的增加。Scale-down工艺研发方法可以用实验室规模的反应器有效模拟大反应器中的工艺情况,降低大反应器生产过程中的失败概率,以较小的代价确定大反应器的最佳工艺条件。


三、搅拌式生物反应器及国内外品牌
搅拌式生物反应器是利用电机带动搅拌桨叶混合培养罐中的培养液这种形式的生物反应器,主要为机械搅拌式,也有一些其它搅拌方式如笼式通气搅拌式等。

动物细胞培养用搅拌式生物反应器常见的搅拌桨是斜叶(Pitched-blade)搅拌桨,可用于悬浮细胞的大规模培养,或通过添加低密度微载体用于贴壁细胞的培养。对于高密度微载体的培养,通常会选择细胞提升式(Cell-lift)搅拌桨。

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图3.10常见搅拌式生物反应器搅拌桨示意图
(从左至右分别为:旋转过滤器搅拌桨、细胞提升式搅拌桨、斜叶搅拌桨和螺旋搅拌桨)。
图片由Eppendorf提供。

搅拌式生物反应器的罐体材质有所不同,小型生物反应器罐体通常采用硅硼酸盐玻璃制作,可以在高压灭菌器内进行灭菌,通常用于实验室规模的研究以及生产中的种子细胞制备;大型生物反应器罐体采用不锈钢材质,灭菌方式采用高压蒸汽在线灭菌,主要于中试及大规模生产。近年来迅速发展的一次性生物反应器,大部分也是搅拌式生物反应器。
在大规模生产中,传统的搅拌式生物反应器主要是不锈钢反应器至今仍然是首选。
图3.11 BioFlo Pro不锈钢搅拌式生物反应器。图片由Eppendorf公司提供。

1.跨国公司的生物反应器

早在20世纪60年代,英国就已经利用30L和100L不锈钢反应器进行细胞培养。在欧洲有不少历史悠久的生物反应器公司。

早在20世纪60年代,英国就已经利用30L和100L不锈钢反应器进行细胞培养。在欧洲和美洲有不少历史悠久的生物反应器公司,美国NBS(New Brunswick  Scientific)公司约在1970年开发出世界上第一个商业化的“细胞培养工厂”的动物细胞生物反应器。

到目前为止,跨国公司生物反应器在性能和质量等方面仍然占有比较明显的优势。一方面体现在不锈钢材质、机加工工艺、传感器、阀门等硬件方面品质可靠,另一方面体现在流体设计、工艺数据、过程分析技术(PAT)等软件方面的积累优势。

不锈钢生物反应器的主要跨国公司品牌如下(排名不分先后)。
1)赛多利斯(Sartorius)
德国公司。原贝朗(B.Braun)生物反应器,贝朗公司于2000年被赛多利斯公司收购。
2)艾本德(Eppendorf)
德国公司。2007年收购美国生物反应器公司NBS,2012年收购德国高通量平行反应器公司DASGIP,完善了生物反应器产品线的全覆盖。
3)比欧(Bio        Engineering)
瑞士老牌的生物反应器公司。
4)PG
法国公司,通过收购Biolafitte公司进入生物反应器业务。
5)捷特(Zeta)
奥地利公司。
6)ABEC
美国公司。
7)Applikon
荷兰公司。
8)FiberCell        Systems
美国公司,主营中空纤维生物反应器。
此外,在日本、韩国也有一些反应器供应商。

2.生物反应器的在中国的发展

2008年,清大天一对国内某公司的50L细菌发酵反应器进行设计改造后,成功用于口蹄疫疫苗悬浮培养工艺和蓝耳病疫苗微载体培养工艺的开发。2009年,金宇生物股份利用清大天一自行设计和制造的120L和650L不锈钢机械搅拌式生物反应器建成口蹄疫疫苗生产线,并成功投产,成为国内第一家采用生物反应器悬浮培养工艺生产动物疫苗并上市销售的企业。清大天一也因此开创国产生物反应器的先河,所开发的生物反应器最大体积达到4000L。

随后,很多从事发酵反应罐业务的企业纷纷转型生产生物反应器。据不完全统计,目前国内不锈钢机械搅拌式生物反应器企业有(排名不分先后):齐志、英德、日泰、森松、高机、国强、天信和、弗洛瑞、福尔、百仑、比瑞、保兴、万木春、东富龙、奥星、乔为、楚天、赛思柏欧等。

值得注意的是后四家企业本来是制药设备集成或工程公司,他们把生物反应器系统作为其工程项目的一部分,开发制造了生物反应器产品。


3.生物反应器配套装置和系统

1)控制系统
生物反应器主要由罐体和控制系统两部分组成,因此也有一些企业专营或者兼营生物反应器的控制系统,例如Finesse、Applikon、Bilfinger等公司。自然,也有一些只生产生物反应器罐体,尤其是玻璃罐体、一次性罐体的公司。
2)细胞截留滤器
很多生物反应器培养工艺需要细胞截留装置支持,常见的细胞截留装置有旋转滤器(Spin filter)、切向流过滤器(TFF)、交替式切向流滤器(ATF)和超声滤器(Acoustic filter)。
3)PAT(过程分析技术)
PAT是英文Process AnalysisTechnology的缩写,中文为过程分析技术。2004年,FDA对过程分析技术发布的指导性文件中对PAT的定义为:以确保最终产品质量为目标,通过即时测量原料、过程中物料和工艺过程本身的关键质量和性能属性来实现设计、分析和控制生产步骤的系统。PAT的目标是基于对工艺的理解,通过对生产过程中原料或半成品的关键工艺参数(Critical Process Parameters)的监测、分析和控制,优化参数,实现重复稳定的控制,从而保证能够持续稳定生产出质量如一的产品。PAT系统主要由数据采集与监视控制系统SCADA(Supervisory Control And Data Acquisition)和分析方法软件如DOE、MVDA,以及在位和在线传感器组成,一些新的仪器如过程质谱、拉曼光谱、红外光谱、电容传感器等也被用在系统之中。PAT系统应用于生物制药生产的整个过程,包括上游反应器细胞培养过程的生物分析参数在线监测分析,如细胞活力和密度,葡萄糖、乳酸、谷氨酰胺的监测,以及培养基开发和配方优化;也包括下游目标蛋白和核心缓冲液组分的在线监测、合理布置缓冲液配制和储存罐,等等。

4.生物反应器的质量标准
欧州在2001年颁部了反应器标准《生物技术-容器的性能准则-第四部分:生物反应器》(EN 13311-4-2001 Biotechnology-Performance criteria for vessels-Part4:Bioreactors)。该标准规定了生物反应器分类的技术指标和检验方法,包括密封性、清洁性、可消毒性等。该标准注重对操作人员的安全性及对环境的保护性,但对体现生物反应器产品质量的指标和检验方法,包括反应器性能如支持细胞生长的效果方面没有详细要求。

2011年,由清大天一起草的中华人民共和国制药机械行业标准《机械搅拌式动物细胞培养罐(JB/T20137-2011)》(Mechanical stirred-tank bioreactor for animal cell cultivation)颁布实施。该标准对生物反应器的材料、受压零部件设计与制造、外观、性能、电气安全等方面做出明确的规定,确保生物反应器罐体符合国家《固定式压力容器安全技术监察规程》及《压力管道安全技术监察规程》的要求,性能方面特别提出利用生物反应器进行动物细胞悬浮培养的要求,以验证生物反应器系统在满足动物细胞培养方面所具备的条件。


四、一次性生物反应器

1.一次性生物反应器的发展

一次性生物反应器,Single-Use Bioreactor。制药一次性使用系统可以溯源至20世纪40年代末,从那时起开始用PVC塑料袋替代玻璃瓶收集血浆,极大地提高了无菌性和安全性,且成本低廉。随后一次性塑料袋逐步用于药包材、以及培养液和缓冲液的储运等。在一次性生物反应器方面,1999年WAVE一次性生物反应器诞生,2004年推出搅拌式一次性生物反应器,到2008年相继出现10-15mL可放大微型一次性生物反应器,以及2000L生产规模的一次性生物反应器,至此一次性生物反应器已经可以应用在生物制药行业从研发到生产的各个阶段。

各大生物工艺技术公司通过研发和并购等方式竞相加入到一次性生物反应器的浪潮中。随着赛默飞世尔Hyclone率先推出搅拌式一次性生物反应器,赛多利斯、思拓凡(Cytiva)(丹纳赫(Danaher)旗下,原GE生命科学(GE Life Science))、德国默克、颇尔、艾本德等公司都相继推出各种样式的一次性搅拌式生物反应器。

发展至今,一次性生物反应器结合连续培养工艺,已经成为生物制药工艺的发展方向之一。

2.一次性生物反应器的优势

应该说制药一次性系统是伴随科技进步、新药研发加快、法规要求提高、以及商业模式发展而发生和发展的,一次性生物反应器的优势主要体现在以下几个方面。

1)前期投入少,建设快,工艺灵活性高
与采用不锈钢生物反应器系统相比,采用一次性生物反应器系统工厂建设时间短,前期投入少,工艺灵活性高,满足了生物制药发展的节奏和需求。一方面药品研发周期长、投入高、成功率低的特点促使企业尽可能减少早期固定资产投资,一次性系统恰恰符合这个需求。另一方面,药品研发和报批如同赛跑,采用一次性系统建设周期比不锈钢系统缩短一年以上,有利于企业在新药报批和上市进程中占得有利的市场竞争地位。
2)污染和交叉污染风险低
与不锈钢生物反应器系统相比,所有一次性系统设备均经过清洁灭菌和验证,可以直接使用,无需CIP(在位清洁)、SIP(在位灭菌)和验证流程、节省时间、减少设备占用空间、减少人力、减少注射用水使用量。在生产不同品种时,不存在解决清洁以避免交叉污染的问题,甚至很容易移动到另外一个生产空间。生产出来的中间体不需要另外更换容器,不仅方便,也减少污染的可能性。
3)从小到大,适合研发
一次性系统非常适合同时多个品种和工艺的研发,以及小公司、小规模的研发和生产。一次性生物反应器在研发时的优势是非常明显的。使用微型一次性生物反应器开发的工艺,具有极好的放大延展性。根据一份默沙东的研究报告,使用250mL一次性生物反应器培养细胞,与放大到2500L甚至15000L的各种大体积生物反应器比较,在细胞密度、活力以及表达等指标方面相差无几。AspenBrook咨询公司2015年全球细胞培养和发酵市场调查报告显示,有接近50%的用户拥有1L以下的微型或袖珍生物反应器,因为它能提供真实的反应器环境以及良好的工艺放大延展性,因此在研发中比摇瓶有明显的优势。
4)有利于MAH模式和技术转移
MAH(Marketing Authorization Holder),药品上市许可持有人。采用一次性工艺设备既能有效避免受托企业生产中的交叉污染,也有利于以药品研发为主要业务的上市许可人更方便的掌控生产过程的GMP管理和产品质量。采用一次性系统也更有利于药品研发单位的技术转移。

3.一次性生物反应器存在风险和需要考虑的问题

一次性系统也不是十全十美的,甚至也不能完全替代传统的不锈钢生物反应器系统。与传统不锈钢系统工艺对比,一次性系统存在以下风险和问题。

1)自动化程度降低
通常一次性生物反应器需要逐批更换安装作为耗材的一次性袋子,因此大大降低了系统的自动化程度,人工操作增多,差错风险加大。

2)一次性耗材对生产过程的影响尚不明确
目前一次性袋子可能的浸出物、可提取物、脱落物等对生产过程的影响,如细胞培养、表达以及产品质量的影响等方面的研究还不够充分。

3)现场进行完整性测试比较困难
虽然有些公司推出完整性测试设备,由于每个袋子检测时间需要几十分钟,加上场地等问题,用户通常只可能对半成品等特别重要的袋子进行检测,而一次性生物反应器的袋子完整性完全依赖供应商的质量和检测。

4.国内外一次性生物反应器供应商和产品

跨国公司的一次性生物反应器主要是搅拌式反应器,此外还有波浪式生物反应器。一些跨国公司开始在中国建立一次性生物反应器的袋子生产工厂,以降低成本,占据市场优势。

拥有搅拌式一次性反应器的公司如下(排名不分先后)。
1)赛多利斯(Sartorius)
赛多利斯的一次性生物反应器是以其不锈钢搅拌式生物反应器产品为基础设计的。此外,赛多利斯的ambr系列高通量微型一次性生物反应器,最小体积可达10mL,用于细胞株筛选、细胞培养基开发或工艺参数的筛选实验等。
2)思拓凡(Cytiva)
丹纳赫(Danaher)旗下,原GE生命科学(GE Life Science)。
3)艾本德(Eppendorf)
艾本德利用了其在耗材领域的优势,开发出塑料材质的硬质一次性生物反应器,刚性设计,模拟传统反应器,提高研发效率,同时减少了溶出和析出的风险。艾本德也是目前市场中50L以下一次性生物反应器产品线最全的供应商。
图3.12 BioBLU一次性生物反应器。图片由Eppendorf公司提供。

4)德国默克(Merck)
5)赛默飞世尔(Thermo        Fisher)
6)颇尔(Pall)
7)ABEC
ABEC于2019年宣布推出6000L工作容量的一次性生物反应器,这是目前最大的一次性生物反应器。
8)佐竹化学(Satake)
9)龙沙(Lonza)
拥有波浪式一次性生物反应器的跨国公司主要是:
1)思拓凡(Cytiva)
2)赛多利斯(Sartorius)

目前,国产一次性生物反应器还不多,主要有:
1)浙江金仪盛世,激流式一次性生物反应器。
2)、3)广州齐志、武汉赛科成,波浪式一次性生物反应器。


五、国内生物反应器行业的问题与思考

据不完全统计,国内生物反应器企业近20家,且几乎都是不锈钢搅拌式反应器,行业竞争异常激烈,但质量和技术水平仍然不高。建议从以下几方面改进。

1.硬件品质保证
包括确保316L不锈钢材质,提高机加工精度和水平,以及阀门、传感器的择优选择等。在这方面,后进入市场的制药工程公司应该更具有优势,尤其在大体积和超大体积生物反应器生产线工程。

2.流体设计
借助流体力学模型对生物反应器的搅拌桨系统进行设计和优化,使之更有利于细胞培养工艺需求。

3.生物工艺开发和技术支持
开发更优的生物反应器工艺,并为用户提供技术支持。

4.开发全自动细胞培养系统
开发全自动细胞培养系统以满足细胞治疗发展的需求。

5.开发PAT
开发生物工艺过程分析系统PAT,帮助用户不断优化工艺。

6.开拓国际市场
在提高和保证生物反应器产品性能和质量的基础上,开拓国际市场。

7.开发一次性搅拌式生物反应器
目前国产一次性生物反应器不仅较少,而且尚无主流类型的搅拌式一次性生物反应器,应该跟进。


六、细胞工厂

细胞工厂(CellFactory),是另一种贴壁细胞大规模培养的装置,与传统的转瓶培养相比,细胞工厂充分挖掘和利用了培养表面,从而在有限的空间里实现细胞的大规模培养,并节约细胞培养基。同时,细胞工厂还可以有效保证操作的无菌性,避免污染。细胞工厂与相应的操作设备合使用,可实现细胞培养的自动化。

在生产中,有全部采用细胞工厂的工艺,也有采用细胞工厂进行种子细胞扩增后接种给生物反应器中继续培养的。

跨国公司品牌的细胞工厂主要是康宁(Corning)和赛默飞世尔的NUNC,其中NUNC在苏州建有生产工厂。

国内也有一些企业开发生产细胞工厂产品,例如赛泊泰、鼎昊源、耐思等。

下期预告:第三部分生物离心


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发表于 2021-1-20 13:50:59 | 显示全部楼层 |阅读模式

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