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生物咖啡茶


生物工艺行业(二)(附) 牛血清

张韧


一、牛血清的功能

在细胞体外培养的早期,培养细胞时采用的大多是天然培养基,即直接取自于动物组织提取液或体液,如血浆、血清、淋巴液、胚胎浸出液等。目前尚在使用的天然培养基主要有牛血清(Bovine Serum)以及其它动物血清等。

细胞培养中常用的牛血清是一种组份复杂且尚不完全明确的混合物,含有上千种蛋白质,总蛋白量高达60~150g/L,提供细胞生长所需要一些生长因子、激素、贴附因子和营养物质。通常在基础细胞培养基中添加5%~10%的牛血清用于细胞培养。

目前大多数人用疫苗和兽用疫苗的研发和生产过程仍需要添加适当比例的牛血清。例如人用疫苗中,利用Vero、地鼠肾细胞生产狂犬病疫苗,利用二倍体细胞生产甲肝疫苗和水痘疫苗等。再如兽用疫苗中,利用BHK21细胞生产口蹄疫疫苗,利用Marc145细胞生产猪繁殖与呼吸综合征(蓝耳病)疫苗,利用ST细胞生产猪瘟疫苗,利用PK15细胞生产圆环病毒疫苗、伪狂犬疫苗,利用的Vero细胞生产小反刍兽疫、狂犬病疫苗,等等,这些疫苗生产或多或少都需要用到牛血清。

除了促细胞贴壁和细胞生长之外,牛血清还在一些病毒培养生产过程中被用作保护剂。

牛血清在体外诊断试剂生产中也有较多应用,如封闭液、稀释液等,其作用与牛血清白蛋白(BSA)类似,起保护作用。

由于牛血清在人用疫苗和兽用疫苗生产中起到比较重要的作用,所以在人药药典和兽药药典中都专门都给出了有关定义和质量标准。

然而牛血清来源于动物且成份复杂,因而批间差大且很难控制,同时存在海绵状脑病(TSE,如疯牛病)等病毒污染的风险,这些给生物制品的生产质量和药品的安全性带来不确定性,因此生物制药生产的发展趋势是尽可能减少牛血清的使用。另一方面,牛血清企业需要保证牛血清产品的质量,尤其是从源头控制好牛血清原料的质量。



二、国内外牛血清产品和法规

1.牛血清的来源
牛血清来源于家牛的血液,是凝血或去纤维蛋白的全血离心后的上清成分。

牛血清是肉类工业的副产品。在屠宰时,可以从成年牛、小牛、非常年幼的小牛或在屠宰后发现牛怀孕时从胎牛身上取血,也可以来自于被称为“供体”的动物,它们不止一次献血。

通常以取血时牛的年龄定义牛血清的分类。供血牛的年龄会影响牛血清的特性,例如不同牛龄的牛血清的IgG(免疫球蛋白G,Immunoglobulin G)含量有较大差异。

此外,还有γ射线辐照胎牛血清、热灭活胎牛血清、加铁小牛血清、配方饲养小牛血清、去除IgG牛血清等等。

2.牛血清有关法规
由于牛血清在人用疫苗和兽用疫苗等生物制药生产中非常重要,很多国家都将其纳入药典。在我国的《中华人民共和国药典》和《中华人民共和国兽药典》中,以及美国药典USP、欧洲药典EP中,都规定了牛血清的定义和质量标准。

3.美国药典牛血清分类
按照美国药典,不同年龄来源的牛血清产品按如下分类。所有牛血清都是在经过政府检查和注册的屠宰场中收集的。

1) 胎牛血清
胎牛血清,简称FBS(Fetal Bovine Serum),是从健康的产前母牛的胎儿中获得的,这些母牛经有执照的兽医在其死前和死后检查后被认为适合人类食用。
2) 新生小牛血清
新生小牛血清,简称NBCS(Newborn Calf Serum),又称Newborn Bovine Serum,是从20天以下的牛身上获得的。
3) 小牛血清
小牛血清,Calf Serum,是从20天到12个月的牛身上获得的。
4) 成牛血清
成牛血清,简称ABS(Adult Bovine Serum),是从12个月以上的牛身上获得的,这些牛被宣布适合人类食用。
5) 供体牛血清供体牛血清,Donor Bovine Serum,也称为Donor Calf Serum,是从受控的经政府检查和注册的供体牛身上反复抽血而获得的。这些牛的年龄在12-36个月。

4.欧洲药典牛血清分类
欧洲药典强调牛血清只能来源于无疯牛病(BSE)风险或疯牛病风险可控的国家。
1) 胎牛血清
取自未出生的牛。
2) 供体小牛血清
取自小于1年的供体牛。
3) 供体成牛血清
取自小于3年的供体牛。
4) 小牛血清
取自小于1年的牛。
5) 成牛血清
对于无疯牛病风险国家,取血牛龄不做限制。
对于疯牛病可控国家,取血牛龄小于21个月。

5.中国药典对牛血清的规定
2015版《中华人民共和国药典》对新生牛血清定义为:本品系从出生14小时内未进食的新生牛采血分离血清,经除菌过滤后制成。牛血清生产过程中不得任意添加其他物质成分。

2015版《中华人民共和国兽药典》对牛血清的定义为:
1) 新生牛血清
出生14小时内未进食初乳的新生小牛采血,分离血清,经过滤除菌制成。
2) 胎牛血清
经心脏采集230-240日龄的胎牛全血,分离血清,经过滤除菌制成。

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图2.1国产胎牛血清和新生牛血清。
图片由金源康生物提供。

应当注意的是,新生牛血清NBS(Newborn Serum)是国内特有的牛血清品种,与国外的新生小牛血清NBCS(Newborn Calf Serum)虽然只差一个字,但取血牛的年龄不同,因此不是同一种牛血清产品,不能混为一谈。二者的差别见表2.1。


表2.1新生牛血清与新生小牛血清的区别


由于牛血清是天然成分,因而原料对于牛血清产品质量至关重要。国际血清行业协会ISIA(International Serum Industry Association)自2009年以来一直在发展可追溯性认证计划,这对确保每个批次牛血清的质量、安全性和重复性起了重要作用。

在国内,按照现行定点屠宰规定,如何保证牛血清原料的溯源性,如何保证和验证“出生14小时内未进食的新生牛采血分离血清”这一药典标准是牛血清生产企业面临和需要解决的问题。

据金源康生物官网和官微介绍,为保证牛血清原料的溯源性,该公司与多家大型牛源基地合作,建立公司的血清原料采集站以实现对牛血清采集的过程控制。同时采取母体筛选、全封闭无菌采血等措施,使所有牛血清产品均可追溯其来源及母体健康状况,通过控制原料质量来保障牛血清产品的品质。

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图2.2 牛血清原料质量控制:无菌采血。图片由金源康生物提供。



三、国外疫苗生产过程中使用的牛血清

与国内规定的通常只能采用新生牛血清和胎牛血清生产疫苗(部分兽用疫苗除外)截然不同的是,胎牛血清、新生小牛血清、小牛血清、成牛血清在国外的疫苗生产和研发中都有应用。


1.FDA批准的部分人用疫苗情况
FDA批准的部分人用疫苗的工艺成分中有胎牛血清、新生小牛血清或小牛血清,分别见表2.2、表2.3和表2.4。

表2.2采用胎牛血清生产的疫苗
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以上数据更新于2016年9月

*工艺成分指疫苗制造过程中使用的物质,包括细胞培养材料、灭活成分、抗生素等。可能出现在最终疫苗产品中,也可能不出现在最终疫苗产品中。下同。

表2.3采用新生小牛血清生产的疫苗
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以上数据更新于2016年9月。


表2.4采用小牛血清生产的疫苗
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上数据更新于2016年9月。


上述FDA批准的人用疫苗生产中,有3种疫苗生产的培养基中添加胎牛血清,1种疫苗添加新生小牛血清,7种疫苗添加小牛血清(其中有1种疫苗同时使用胎牛血清和小牛血清)。


2.兽用疫苗研发与生产
全球约30余家口蹄疫疫苗生产企业,国外的口蹄疫疫苗生产主要采用成牛血清,包括兽用疫苗行业熟知的巴西、阿根廷等南美国家多家口蹄疫疫苗生产企业,也包括亚洲的多家口蹄疫疫苗生产企业。我国已投产的杨凌金海公司生产的口蹄疫疫苗,就是采用阿根廷Biogenesis公司的成牛血清悬浮培养生产工艺。
在著名的英国Pirbright研究所,很多研究口蹄疫疫苗和狂犬病疫苗的试验都采用不分年龄段的牛血清或者成牛血清培养BHK-21细胞。


四、国内外品牌和供应商

1.跨国公司
20世纪60年代,Gibco公司开始生产细胞培养用牛血清。1967年,Hyclone公司最先使用高效过滤方法生产出低细菌内毒素和血红蛋白的高品质牛血清,大大提高了FBS的质量和促生长特性。
通常细胞培养基公司也是牛血清的主要供应商,以下是几家著名的跨国公司及其牛血清产品品牌(排名不分先后)。
1.赛默飞世尔(Thermo        Fisher),Gibco。
2.德国默克(Merck),Sigma-Aldrich。
3.思拓凡(Cytiva),Hyclone。
丹纳赫(Danaher)旗下,原隶属于GE生命科学(GE Life Science)。4.康宁(Corning)

2.国内牛血清行业发展和企业情况
从20世纪80年代中期起,为了满足疫苗生产需求,替代进口牛血清产品,国内诞生了四季青、民海、佰安等牛血清企业生产企业。据不完全统计,目前国内有20余家牛血清生产企业,但其中大多数企业仍然只有血清业务,这与跨国公司在生物工艺技术方面的发展差距较大。不过,已经有企业涉足生物工艺其它领域的业务。例如金源康生物在牛血清业务基础上开发建立了培养基业务,生产疫苗用细胞培养基和发酵培养基等产品。同时参股成都依思康医药科技有限公司,这是一家从事佐剂、免疫增强剂、冻干保护剂等生物技术产品业务的公司。

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图2.3牛血清企业从加工型向生物工艺技术方向发展。图片由金源康生物提供。


2002年起,中国医药生物技术协会启动牛血清生产企业质量达标认证,以行业自律的形式规范牛血清的生产和质量管理,对牛血清行业发展起到积极作用。但在生产应用中,用户一直采用多批次反复试错的筛选方式,给用户和牛血清企业都增加了不小的成本和时间周期。这说明牛血清产品的性能和质量还存在问题,主要体现在:
  • 牛血清产品依赖原料,但对原料的质量控制和组分研究不够。
  • 简单的加工工艺不足以应对牛血清原料的复杂性以及用户对牛血清产品的个性化使用需求。
  • 作为原料的牛血清质量标准,应该以其对产品生产工艺和最终产品质量的直接影响为基础,现行质量标准在这方面的要求显得不足。



国内疫苗生产对牛血清需求较大,由于缺少技术壁垒,所以牛血清生产企业数量较多,据不完全统计有(排名不分先后):金源康、依科赛、民海、天杭、荣晔、普优、润生、草原绿野、蕊特、维克生、劲牛、政博伟业、元亨圣马、三利、康源、宏伟、博莱特、西诺、维远、一祺等。


五、国内牛血清行业存在的问题与思考

尽管无血清培养生产疫苗的呼声越来越高,载体疫苗、病毒样颗粒VLP(Virus Like Particle)疫苗、亚单位疫苗等新型疫苗的发展势头向好,但目前疫苗生产的主流工艺中仍然需要牛血清,除了细胞培养之外,有些病毒培养需要牛血清做保护剂。另一方面,作为工艺成分之一的牛血清在疫苗生产中也已经历半个多世纪的使用与验证。可以预测,在今后一段时间里,疫苗生产仍然需要牛血清。对于用户和牛血清企业来说,牛血清的质量差异大、价格居高不下是亟需解决的关键问题。
胎牛血清最高级别的牛血清。病毒风险、细菌内毒素水平、抗体水平最低,用于科研、细胞驯化和生物工艺研发、以及分析检测的胎牛血清,在国内市场上也比较复杂。进口胎牛血清中除了跨国公司的产品之外,还有一些代理商代理销售一些不知名的进口胎牛血清产品。由于国内胎牛血清原料紧俏,有一些国内牛血清企业推出准胎牛血清,从新生牛血清原料中筛选出一些品质较好的充当准胎牛血清原料进行生产。这种做法并不可取,一方面这种准胎牛血清与胎牛血清在IgG含量等方面有很大差异,有可能影响使用;另一方面则是降低了其本来已不稳定的新生牛血清品质。
牛血清的市场竞争激烈程度胜过细胞培养基,但与后者不同的是,牛血清不是一个具有上升市场空间的行业,同时由于国内牛血清产品分类、质量、成本等差距而不具备进入国际市场的可能性。在这种情况下,国内牛血清企业应该从以下几个方面考虑自身的发展。


  • 改进质量标准和检测方法
现行药典的牛血清质量标准更多是从产品安全性角度考虑,而对于使用效果帮助不大,用户都要另外采用试错的方法进行筛选。作为牛血清生产企业应该从用户角度考虑,从原料到产品建立更科学的内控质量标准和检测方法。

  • 改进生产工艺
基于国内牛血清原料不可控性的实际情况,改进牛血清加工生产工艺,提升牛血清产品使用效果、减小批间差和批内差,势在必行。

  • 研发个性化牛血清产品
开发符合用户个性化需求的牛血清产品,减少甚至免除用户试错的时间和成本。

  • 推动牛血清产品分类标准修改
一方面国内新生牛血清的溯源性面临挑战,也无法通过检验判断新生牛血清及其原料的牛龄是否符合药典规定的出生后14小时内且未进食的要求;另一方面我国的新生牛血清与国际上牛血清商品分类存在差异。与国际接轨不仅有利于解决牛血清原料的溯源性问题,也使得符合规定的国外牛血清产品可以合法使用,有利于平抑新生牛血清居高不下的价格。实际上市场上也已经出现将新生小牛血清(NBCS)以新生牛血清命名出售的产品,对现行药典定义提出挑战。

  • 引入新兴技术业务
从长期发展看,以简单加工为主的牛血清行业发展空间有限,对于有着持续发展愿景的企业来说,引入生物工艺行业中技术含量高的细分业务迫在眉睫。


下期预告:第二部分 生物反应器

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发表于 2021-1-20 12:10:00 | 显示全部楼层 |阅读模式

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