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生物咖啡茶

灌流培养基的开发、筛选及性能验证

张韧



“下一代生物工艺技术百家争鸣,这是产品创新的一个大领域。最终,您可以设想这样一个未来:通过强化单个制造步骤或单元操作,然后压缩和连接连续的单元操作,以连续流的方式生产生物制品。”

2018年,德国默克旗下MilliporeSigma工艺解决方案执行副总裁Andrew Bulpin博士在接受GEN采访时这样说。

2019年2月26日,美国FDA发布声明推进连续生产,同时颁布连续生产的质量考虑指南草案(Quality Considerationsfor Continuous Manufacturing)。

FDA在声明中指出“连续生产是提高药品质量和效率的关键一步”。FDA“支持采用这种创新技术的早期用户,并期待与其他感兴趣的公司合作”。

灌流培养是连续生产的核心工艺技术,近几年,灌流(连续)培养生产重组蛋白和病毒颗粒方面发表的文献也很多,例如图1和图2。


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图1:用于重组蛋白生产的哺乳动物细胞灌流培养(Bielser JM,et al. Biotechnology Advances, 2018.)



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图2:病毒颗粒的连续生产(S.Gutierrez-Granados,et al. Current Opinion In Chemical Engineering. 2018.)


1.  灌流培养

灌流培养(Perfusion Culture)是生物反应器细胞培养的三种工艺方式之一,指细胞培养过程中不断添加培养基补料,同时通过细胞截留滤器排出培养液的废液和产物收获液,而活细胞被截留在反应器中的一种操作方式。

通过对灌流培养工艺的灌流速率、培养基补料成分等方面进行优化,以实现高密度、高表达的工艺效果,从而减小培养体积和场地空间,提高产量,降低成本。
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图3:灌流培养示意图


2.  灌流培养基

灌流培养所需要的培养基通常有基础培养基、灌流培养基,其中灌流培养基还可能细分为细胞扩增灌流培养基和蛋白(病毒)表达灌流培养基。在文献中,灌流培养基往往被称为Feed,与补料分批培养的补料Feed是同一个词。

图4是市场中的一些商品灌流培养基(PerfusionMedium),目前这类商品化灌流培养基还不多,很多情况是利用补料分批培养的基础培养基和补料进行筛选组合。

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图4:商品灌流培养基,左图为进口灌流培养基,右图为国产迈邦生物灌流培养基。


3.  灌流培养基的开发和优化策略

通常采用基础培养基与一定比例的补料分批培养的补料培养基(Feed)组合成灌流培养基,用于灌流培养工艺开发。

一些跨国药企,例如默沙东和勃林格殷格翰都分享过他们开发灌流培养基的经验。

(1)   默沙东(MSD)

“在我们的补料分批平台的基础培养基和补料培养基的基础上,我们成功地开发了灌流培养基。一个系统的开发方法是首先优化补料分批培养的基础培养基和补料培养基的比例,然后有针对性地去除不必要和多余的成分。随着组分的减少,培养基可以进一步浓缩2倍以增加培养基的浓度。”

(2)   勃林格殷格翰(BI)

“对于像勃林格殷格翰这样的采用传统补料分批培养工艺的公司来说,开发一个没有现成技术的灌流工艺需要利用现有的补料分批培养工艺平台知识。采用这样的路线开发一种用于灌流培养的培养基依赖于设计基础培养基和补料培养基的最佳混合物,这种混合物可以作为开始灌流培养基开发的坚实基础。开发灌流培养基的一个重要考虑是控制和减少不必要的细胞生长。”


在开发和优化灌流培养基的时候,一般需要考虑以下策略和方法。

(1)   基于补料分批平台的基础培养基和补料建立灌流培养基

用不同比例的补料分批基础培养基和补料混合配制灌流培养基的方法是一个有效的策略。

(2)   创造更多的化学空间来增加灌流培养基的浓度

通过测量培养液营养成分的变化,有针对性地去除不必要和多余的组份,增加灌流培养基的浓度,减少批间差的可能性。

细胞培养基浓度越高,维持稳定高活力所需的灌流率越低,培养基使用越少。

(3)   重新平衡能力代谢氨基酸,控制细胞生长,提高产物的产量。

(4)   确认灌流培养基在生物反应器上的性能。

(5)   确认临界细胞特异性灌流速率(CSPR=灌流速率/细胞密度),以保持稳定状态。

灌流速率基于以下三个方面因素的综合考虑:

a)  基于细胞密度或细胞特异性灌流速率(CSPR)。

b)  基于培养液中主要底物的可用性,如葡萄糖浓度。

c)  基于培养液中某一副产物的浓度,如乳酸或氨浓度。

灌流工艺优化良好的情况下将形成各方面平衡的工艺,底物被有效利用。达到稳定状态时,以上三个主要因素将会融合。所以,例如基于CSPR开发的工艺可使用底物测量来优化控制以进行生产。

(6)   确认培养基的可放大性和设备适配性。


4.  灌流培养基的筛选和性能验证

迈邦生物开发出Perfusion CHO MaxA、Perfusion CHO MaxA1、Perfusion CHO MaxA2 、Perfusion CHO MaxA3、Perfusion CHO MaxA4和Perfusion CHO MaxA5等6款灌流培养基,研究人员通过细胞培养、蛋白表达和在反应器中验证三组试验,筛选出适合一株表达单克隆抗体的CHO-S细胞株和一株表达单克隆抗体的CHO-K1细胞株的灌流培养基。

(1)   第一步:灌流培养基筛选试验

使用Perfusion CHO MaxA、PerfusionCHO MaxA1、Perfusion CHO MaxA2 、PerfusionCHO MaxA3、Perfusion CHO MaxA4、Perfusion CHO MaxA5在表达单克隆抗体的细胞株CHO-S 和CHO-K1做细胞生长测试。

测试方法:在50ml摇管中,工作体积20ml, 以0.5million cells/ml 接种细胞,从day2天开始离心细胞全换液,1VVD。不同培养基培养两株细胞的密度和活力情况见图5和图6。


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图5 不同灌流培养基培养CHO-S 和CHO-K1细胞的细胞密度情况。图片由迈邦生物提供。


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图6 不同灌流培养基培养CHO-S 和CHO-K1细胞的细胞活力情况。图片由迈邦生物提供。


试验结果:对于CHO-S克隆细胞株,PerfusionCHOMaxA可以维持胞18天高密度生长,细胞密度为60-70million cells/ml。对于CHO-K1克隆细胞株,PerfusionCHO MaxA1、Perfusion CHO MaxA2 和Perfusion CHO MaxA3 可以维持细胞18天高密度生长,细胞密度为40-50 million cells/ml。上述几种培养基作为候选进入后续试验。

(2)   第2步:工艺优化和蛋白表达试验

使用Perfusion CHO MaxA灌流培养基培养CHO-S克隆细胞株,Perfusion CHO MaxA1、Perfusion CHOMaxA2 、Perfusion CHOMaxA3灌流培养基培养CHO-K1克隆细胞株,在培养工艺优化的条件下测试细胞生长和蛋白表达。

测试方法:在50ml摇管中,工作体积20ml, 以0.5million cells/ml 接种细胞,从day2天开始离心细胞全换液,当CHO-S细胞株和CHO-K1细胞株密度超过50 million cells/ml时开始bleeding策略操作,同时开始降温到34度。

Bleeding 策略通常用于灌流培养,通过去除过量生长的细胞和培养基废液,以延缓营养成分的消耗,保持细胞活率并连续表达,同时防止死亡细胞的累积。

不同培养基培养两株细胞的密度、活力和蛋白表达情况见图7、图8和图9。


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图7 使用Perfusion CHO MaxA灌流培养基培养CHO-S克隆细胞株,使用Perfusion CHO MaxA1、Perfusion CHOMaxA2 、Perfusion CHOMaxA3灌流培养基培养CHO-K1克隆细胞株的细胞密度情况。图片由迈邦生物提供。


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图8 使用Perfusion CHO MaxA灌流培养基培养CHO-S克隆细胞株,使用Perfusion CHO MaxA1、Perfusion CHOMaxA2 、Perfusion CHOMaxA3灌流培养基培养CHO-K1克隆细胞株的细胞活力情况。图片由迈邦生物提供。


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图9 使用Perfusion CHO MaxA灌流培养基培养CHO-S克隆细胞株,使用Perfusion CHO MaxA1、Perfusion CHOMaxA2 、Perfusion CHOMaxA3灌流培养基培养CHO-K1克隆细胞株的蛋白表达情况。图片由迈邦生物提供。


试验结果:降温到34度并采用Bleeding策略操作,活细胞密度波动比第一轮实验小,在后期的细胞活力维持方面也比第一步试验结果优秀。在CHO-S克隆细胞株上Perfusion CHO MaxA可以维持细胞高密度(60-70 million cells/ml)细胞生长,且表达量较高。在CHO-K1克隆细胞株上Perfusion CHO MaxA1和Perfusion CHO MaxA3的蛋白表达量略高。

(3)   第3步:验证灌流培养基在生物反应器中的表现

验证Perfusion CHO MaxA培养CHO-S克隆细胞株,Perfusion CHO MaxA1和Perfusion CHO MaxA3培养CHO-K1克隆细胞株在生物反应器中的表现。

测试方法:使用搅拌式生物反应器进行灌注培养,工作体积3L, 以0.5 million cells/ml接种细胞,从day4天开始灌注,临界细胞特异性灌流速率为CSPR=50,当CHO-S细胞密度超过60million cells/ml时进行bleeding 操作,当CHO-K1细胞密度超过50 million cells/ml时进行bleeding 操作,同时开始降温到34度。

上述培养基在生物反应器中培养两株细胞的密度、活力和蛋白表达情况见图10、图11和图12。


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图10 在生物反应器中,使用Perfusion CHO MaxA灌流培养基培养CHO-S克隆细胞株,使用Perfusion CHO MaxA1和Perfusion CHOMaxA3灌流培养基培养CHO-K1克隆细胞株的细胞密度情况。图片由迈邦生物提供。


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图11 在生物反应器中,使用Perfusion CHO MaxA灌流培养基培养CHO-S克隆细胞株,使用Perfusion CHO MaxA1和Perfusion CHOMaxA3灌流培养基培养CHO-K1克隆细胞株的细胞活力情况。图片由迈邦生物提供。


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图12 在生物反应器中,使用Perfusion CHO MaxA灌流培养基培养CHO-S克隆细胞株,使用Perfusion CHO MaxA1和Perfusion CHOMaxA3灌流培养基培养CHO-K1克隆细胞株的蛋白表达情况。图片由迈邦生物提供。


试验结果:在生物反应器培养试验中,使用Perfusion CHO MaxA灌流培养基培养CHO-S克隆细胞株,使用Perfusion CHO MaxA1和Perfusion CHOMaxA3灌流培养基培养CHO-K1克隆细胞株的细胞密度、活力和蛋白表达与第2步在摇管中一致。

通过灌流培养基筛选试验、工艺优化和蛋白表达试验和验证灌流培养基在生物反应器中的表现3步试验,成功筛选和验证了高性能的适合CHO-S克隆细胞株的Perfusion CHO MaxA灌注培养基,和高性能的适合CHO-K1克隆细胞株的Perfusion CHO MaxA1、Perfusion CHO MaxA3灌注培养基。它们可以支持50-60million/ml的高细胞密度,细胞活力维持在95%以上,day10天以后可以维持稳态到20天。


虽然灌流培养是一种传统的细胞培养方式,但在生物药品和连续培养工艺快速发展的今天,灌流培养基对于培养工艺的效果、稳定性和成本起到关键作用,因此对灌流培养基的开发、筛选和验证应该给予足够的重视。

感谢上海迈邦生物科技有限公司为本文提供的试验数据和图片。

(2020年12月29日)


参考文献

[1] BielserJ M , Wolf M , Souquet J , et al. Perfusion mammalian cell culture forrecombinant protein manufacturing – A critical review[J]. BiotechnologyAdvances, 2018:1328.

[2] Gutiérrez-Granados,Sonia, Gòdia, Francesc, Cervera L . Continuous manufacturing of viralparticles[J]. Current Opinion in Chemical Engineering, 2018, 22:107-114.

[3] LinH , Leighty R W , Godfrey S , et al. Principles and approach to developingmammalian cell culture media for high cell density perfusion process leveragingestablished fed‐batch media[J]. Biotechnol Prog, 2017, 33(4).

[4] MatuszczykJ C, Schulze1 M, Janoschek1 S, et al. Cost Effective 2D Rocking MotionBioreactors with Internal Filters are Compatible with High Cell DensityPerfusion Cultures (up to 170 Million Cells per mL), and Offer SignificantAdvantages for Seed Train Handling. sartorius stedim biotech

[5] WenZ Y , Chen F . A perfusion-cell bleeding culture strategy for enhancing theproductivity of eicosapentaenoic acid by Nitzschia laevis[J]. AppliedMicrobiology and Biotechnology, 2001, 57(3):316-322.



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发表于 2021-1-20 08:55:54 | 显示全部楼层 |阅读模式

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