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生物咖啡茶

生物工艺行业(一)细胞培养基

张韧



小编的话

生物制药的发展使得生物工艺行业越来越受到关注。客观地说,生物制药的生产技术依赖于生物工艺并伴随其发展而发展,而生物制药的需求促进生物工艺技术的创新和发展。

为帮助生物制药行业更全面地了解生物工艺的现状和发展趋势、选择更好的供应商和合适的产品,帮助投资机构了解生物工艺行业及其上下游细分领域的市场情况、做出更明智的投资决策,帮助生物工艺行业了解自身所处的市场及发展方向、制定更清晰的企业发展战略,生物咖啡茶微信公众号将以连载的形式推出张韧先生新作:《日受关注的生物工艺行业》。

本文分细胞培养基、牛血清、生物反应器、生物离心、过滤、层析、CDMO和生物工艺行业发展趋势共八部分。作为致力于生物工艺技术研发与转化、以及企业管理和技术咨询服务的好思康公司创始人,张韧先生在文章中介绍和讨论了生物工艺各主要细分领域的状况、内在规律以及发展趋势与思考。这也将是国内第一篇全面介绍生物工艺行业的研究资料。

欢迎将您的建议、观点、想法和需求在文章后留言或发邮件给编者,编者邮箱:admin@cafmetea.com



日受关注的生物工艺行业

张韧


谨以此文献给曾经和正在为生物工艺发展贡献的所有同仁!献给支持和帮助生物工艺发展的所有朋友!


生物工艺,Bioprocess,又称生物过程,主要指抗体药物、细胞治疗、疫苗等生物药品的生产工艺和过程。生物工艺涉及与之相关的设备、耗材和工艺技术服务等,按照生物药品生产过程,通常分为上游(Upstream)工艺和下游(Downstream)工艺。上游工艺主要有细胞培养基(Cell Culture Medium)和生物反应器(Bioreactor),下游工艺主要有离心(Centrifugation)、过滤(Filtration)和层析(Chromatography),此外还包括为药品研发者以及药品生产企业提供服务的CDMO(Contract Development and Manufacturing Organization,合同研发和生产组织)等。

生物工艺服务于生物制药行业,所以在生物制药发达的欧美,生物工艺行业诞生的也较早,而且比较发达并已成体系。非常重要的一点,生物制药的生产工艺是伴随生物工艺的发展而发展的。生物工艺服务于生物制药行业,而生物制药的生产依赖于生物工艺并随着其发展而发展。

不断降低成本是生物制药行业的目标。2018年全球范围的生物制药行业调查结果显示,有64%的被调查对象正在实施降低设施运营成本计划。降低生物工艺成本不仅是核心,而且已成为常态。不论是生物制药企业还是生物工艺企业,都应该认识到降低成本并不是简单的低价格替换,而应该是通过生物工艺的创新和提高为生物制药企业创造更多价值。

本文拟介绍生物工艺行业中的几个最主要的细分领域,并对该行业未来的发展趋势进行探讨。

本文的编写得到杨于京博士、贠炳岭博士的大力支持和帮助,在此向他们表示衷心感谢!



第一部分 细胞培养基


细胞培养基,英文为Cell Culture Medium,简称CCM,是人工模拟动物细胞的体内生长环境,维持体外细胞存活和增殖的营养物质。细胞培养基的主要功能是提供细胞存活和增殖的适合pH和渗透压,以及细胞本身不能合成的各种营养物质。

广义的细胞培养基也包括牛血清等天然培养基,本文将对用于细胞培养的牛血清做单独介绍,本篇介绍合成培养基。

一、细胞培养基的功能与应用

大部分生物制药是利用动物细胞生产的,包括单抗药物、人用和兽用的大部分病毒疫苗、细胞治疗等,因此动物细胞培养技术是生物制药生产工艺的核心技术,而细胞培养基正是细胞培养的营养物质,是生产的关键因素。

1.  单抗药物

CHO细胞(中国仓鼠卵巢细胞)家族是单抗药物生产的绝对主角,绝大多数单抗药是通过CHO细胞表达的,例如利妥昔单抗、西妥昔单抗、阿达木单抗、贝伐珠单抗、PD-1单抗等等。CHO细胞经过广泛的基因突变和克隆筛选,形成CHO-K1、CHO-DG44、CHO-S、CHO-DXB11等差异性的细胞株,加上其生产的药物不同、培养工艺的差别,所使用的细胞培养基也有所差别。在单抗药物中使用的细胞培养基基本上是化学成分限定培养基(Chemical Defined Medium)和补料(Feed),这也是当前细胞培养基技术的最高水平。


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图1.1粉末细胞培养基和瓶装液体细胞培养基。图片由多宁生物授权使用。


此外,还有一些药物或疫苗采用CHO细胞生产,例如EPO(重组人促红细胞生成素)、重组乙肝疫苗等,一般采用DMEM或者DMEM/F12类经典培养基添加牛血清培养。

2. 人用疫苗

表1.1 部分人用疫苗生产使用的细胞和细胞培养基

  
细胞
  
疫苗
细胞培养基
  
人二倍体细胞MRC-5、2BS、KMB17等
  
甲肝疫苗、风疹疫苗、水痘疫苗、狂犬病疫苗等
基础或改良细胞培养基+牛血清
  
Vero
  
狂犬病疫苗、灭活乙脑疫苗、出血热疫苗、EV71疫苗、IPV疫苗
基础或改良细胞培养基+牛血清,无血清培养基
  
MDCK
  
流感疫苗
无血清培养基
  
CHO
  
重组乙肝疫苗
基础或改良细胞培养基+牛血清,无血清培养基
  
昆虫细胞Sf9等
  
HIV疫苗、HPV疫苗
无血清培养基


3.  兽用疫苗

表1.2 部分兽用疫苗生产使用的细胞和细胞培养基

  
细胞
  
疫苗
细胞培养基
  
ST
  
细小病毒疫苗、伪狂犬病疫苗
基础或改良细胞培养基+牛血清
  
Vero
  
小反刍兽疫疫苗、法氏囊疫苗、猪流行性腹泻疫苗、犬瘟热疫苗
基础或改良细胞培养基+牛血清,无血清培养基
  
MDCK
  
禽流感病毒疫苗、犬副流感疫苗
无血清培养基
  
PK15
  
细小病毒疫苗、猪圆环病毒疫苗、伪狂犬病毒疫苗、猪传染性胃肠炎疫苗
基础或改良细胞培养基+牛血清
  
MDBK
  
牛腹泻病毒疫苗疫苗
无血清培养基
  
Marc145
  
猪繁殖与呼吸综合征疫苗
基础或改良细胞培养基+牛血清
  
BHK21
  
口蹄疫疫苗、狂犬病疫苗、伪狂犬病疫苗
低血清培养基,无血清培养基,CD无血清培养基
  
CHO
  
猪瘟基因工程疫苗
无血清培养基
  
昆虫细胞Sf9等
  
猪圆环VLP疫苗、猪瘟E2蛋白疫苗
无血清培养基


4.  细胞治疗

免疫细胞治疗,如CAR-T、CAR-NK通常采用无血清培养基培养。

干细胞治疗倾向于采用无血清培养基,也有一些用于研究的干细胞培养采用加血清的α-MEM完全培养基。

5.  基因治疗

293细胞广泛应用在基因治疗、溶瘤细胞药物、病毒样颗粒疫苗、病毒载体疫苗等方面的生产,采用化学限定无血清培养基培养。


二、细胞培养基的发展过程和发展趋势

1.  细胞培养基的发展过程和发展趋势

1959年,Eagle首先提出MEM培养基(Minimal Essential Medium)的配方,其基本营养成份是盐、氨基酸、维生素和其他必需营养物的pH缓冲的等渗混合物。在MEM基础上,M199、DMEM、IMDM、HAM F12、PRMI1640等各种合成细胞培养基被不断开发出来。

随后,在20世纪60-70年代诞生了世界上最早的、也是最著名的三个培养基公司:Gibco公司(美国)、HyClone公司(美国)和JRH公司(澳大利亚)。

最初的细胞培养基需要添加一定比例的牛血清才能用于细胞的培养,所以这些培养基公司往往也提供牛血清产品。添加牛血清的培养方式主要用与疫苗生产和科研,到现在仍然有很多疫苗产品生产过程中需要添加牛血清。

为了规避天然来源的牛血清质量的不可控性,尤其是防范海绵状脑病(TSE)如疯牛病等外源病毒的风险,科学家们一直致力于研究牛血清替代物,研发无血清无动物组分的细胞培养基。

20世纪90年代Gibco公司推出的CHO细胞培养基SFM-II是一个标志性的无血清培养基。随后不久,JRH公司推出添加植物水解蛋白的无血清无动物来源成分的CHO细胞培养基EX-Cell 302。而Gibco(当时已经被Invitrogen收购)也没有止步于SFM-II,而是开发了更安全的化学成分限定无血清培养基CD-CHO。虽然当时CD-CHO因为细胞培养效果和成本的原因一度在一些市场上不敌EX-Cell 302,但化学成分限定无血清培养基的问世确立了无血清培养基的发展方向。而含有植物水解物的细胞培养基存在不确定的批间差,并存在植物支原体污染风险,同时也是限制或抑制研究细胞所需养分的瓶颈,所以生物制药公司也很快转换为使用化学成分限定培养基。

重组蛋白药物的研发和兴起带动了对无血清培养基的需求,促进细胞培养基的不断开发,尤其是开发适用于高密度培养、高表达率的不含任何植物水解物的化学成分限定无血清培养基、流加培养补料、个性化培养基等。

纵观细胞培养基的发展历程,经历了从最初需要添加牛血清的经典培养基,到低血清高级培养基,到含有蛋白成分的无血清培养基、含有植物水解物的无动物来源成分无血清培养基,发展到现在成熟的化学成分限定无血清培养基。全球主流的细胞培养基公司,包括国内追随主流的细胞培养基公司,无不具备化学成分限定无血清培养基的研发能力和诸多化学成分限定无血清培养基产品。

细胞培养基优化是提高产率、提高产品质量、提高细胞培养工艺标准化的最重要工具。未来,细胞培养基将继续沿着化学成分限定、无血清培养、成分越来越少、适应连续培养工艺、高密度、高表达的方向发展。

2.  细胞培养基的研发

细胞培养基的研发策略和方法也有多种。例如为替代牛血清而研究牛血清成分,测量细胞培养过程中营养成分的消耗以添加补充等等。总的来说,细胞培养基研发是以试错和试验验证为基础的。高通量筛选法和培养基混合法是目前常用的方法。

最早的混合法是在1980年,Sato将DMEM和F12两种培养基按照1:1的体积比混合,得到DMEM/F12细胞培养基,提高了细胞培养的密度。该培养基也成为后来无血清培养基配方研发的基础。

不论哪一种培养基研发方法,最终都需要通过细胞培养和表达的实际效果进行试验和验证。高通量筛选和试验验证是必不可少的过程,因为即使是培养基混合法,也有不同组分的选择、以及每种组分不同含量等很多种变化。


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图1.2 细胞培养基研发平台。图片承蒙多宁生物授权使用。


3.  细胞株构建与细胞培养

细胞培养基是为培养细胞服务的,而细胞是大多数生物药品和疫苗生产的载体。为了满足新药研发的不断需求,为了提高表达率、提高产量、降低生产成本,细胞株的构建、驯化、改造非常重要,例如从贴壁培养改变为悬浮培养,从加血清培养改变为无血清培养,从低表达率到高表达率等等。这些工作往往是细胞培养基公司主导或者参与完成的。

细胞培养基公司往往建立细胞株开发平台,从客户提供的DNA序列开始,进行载体构建、转染、库细胞筛选、克隆的稳定性研究评估,交付给客户高表达和质量稳定的细胞株。

同时,随着细胞株和细胞培养基的发展,细胞培养工艺也在发展变化,以适应提高产量、降低成本的发展趋势。从流加培养工艺,到现在非常热门的连续培养工艺都是这样。

(1)   全悬浮培养和微载体培养

动物细胞悬浮培养技术依据细胞是否具有贴壁依赖性,分为全悬浮细胞培养和微载体培养。

全悬浮细胞,如CHO细胞、BHK21细胞等,可以在生物反应器中直接进行生产增殖,细胞自由生长、培养环境均一、取样简单、培养操作简单可控、放大方便、污染率和成本低。

微载体培养,贴壁细胞,如Vero细胞、Marc-145细胞、ST细胞等,在生物反应器中培养时需要借助介质表面贴壁,通常是微载体或片状载体,细胞所能达到的密度取决于微载体的数量和生长表面积。相对于全悬浮培养,微载体培养放大工艺相对复杂,成本高。

(2)   连续培养

2019年,美国食品药品监督管理局(FDA)发文支持和推动连续生产。以连续的方式生产生物药品被称为下一代生物工艺技术。细胞连续培养主要是灌流培养,可以获得更高的单位体积产量、缩小生物反应器体积、降低生产线占地以及成本投入,可以获得更高的细胞密度并获得更高的收获,可以连续去除影响细胞生长或蛋白质生产的代谢副产物,可以连续收获产物以减少其在生物反应器滞留时间、防止其质量属性损失。

根据工艺需要,连续培养可以设计为连续培养、半连续培养、两级连续培养、灌流培养与批培养混合培养等不同工艺应用。在连续培养工艺中,灌流细胞培养基,即补料,是一个关键因素。

正因为细胞培养基公司具有细胞株构建和细胞培养工艺开发能力,所以有些企业就延伸介入CDMO业务。


三、细胞培养基的分类

细胞培养基种类繁多,通常有以下常见分类。

1.  按照添加血清情况

(1)   经典培养基

经典培养基,Classical Media,主要指MEM、M199、DMEM、RPMI1640、DMEM/F12等公开配方的传统细胞培养基。这类细胞培养基通常需要同时添加10%左右牛血清配合使用。

(2)  低血清培养基

低血清培养基,Low Serum Medium,在细胞培养时血清添加量低于5%的细胞培养基。

(3)   无血清培养基

无血清培养基,Serum Free Media, 在细胞培养时无需添加血清的细胞培养基。无血清培养基经历了添加替代血清功能的动物成分、无动物来源成分但添加植物水解蛋白、无蛋白或添加微量植物水解蛋白等几个发展阶段。这类培养基的缺点是不利于代谢研究、批间差大等。

(4)   化学成分限定培养基

化学成分限定培养基,Chemically Defined Media,是指无血清培养基中的所有成分都是明确的,不含动物蛋白,也不含植物水解物,这种培养基批间差小,提高了生产工艺的重复性,并有效降低了纯化成本。因为化学成份明确,有利于进行细胞培养的代谢及调控研究。是最安全、最理想的无血清细胞培养基。

2.  按照工艺用途

(1)   基础培养基

基础培养基,Basal Media,用于批培养,或流加培养和灌流培养的基础培养基。

(2)   培养基补料

培养基补料,Feed Media,用于流加培养或灌流培养的培养基补料。生产中的细胞培养通常采用补料策略以提高细胞生长速率、活力,提高产物的产率。培养基补料需要既能满足细胞高密度高产率的培养需求,又尽可能避免同时生成有害代谢产物乳酸和氨。

在流加培养时,补料浓度通常较高,为避免沉淀,一般会拆分成两个组分,在使用时需要两种配合使用,例如多宁生物的DN Feed1 + DN Feed B,DN Feed2 + DN Feed B2,都需要同时补加。

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图1.3 补料培养基,通常会拆分成两个组分,在使用时需要两种配合使用。图片承蒙多宁生物授权使用。


灌流培养用的补料一般采用90%左右基础培养基混合10%左右补料培养基经优化而成。在灌流细胞培养工艺中,由于需要不断补充培养基补料,因此对于补料的需求量比较大。补料也是实现稳态培养的重要因素。

3.  按照产品形态和形状

(1)   液体培养基

液体培养基,Liquid Media,瓶装液体培养基是配制好的细胞培养基,通常为500mL/瓶,可直接使用于科研开发、细胞治疗等领域。

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图1.4 瓶装液体细胞培养基。图片承蒙多宁生物授权使用。


(2)   粉末培养基

粉末培养基,Powder Media,需要用户自行配液和除菌,主要在生物制药的生产中使用。

(3)   定制液体培养基

定制液体培养基,Custom Liquid Media,是培养基厂家为生产型用户在GMP(Good Manufacturing Practices,生产质量管理规范)体系下配制好的大包装液体培养基,培养基通常是用户特定的配方,装在500L或者更大的一次性袋子中配送给用户直接在生产中使用,用户因此节省培养基配液车间、设备和人力,规避污染的风险。

4.  按照细胞分类

不同种类的细胞,使用的细胞培养基也有所区别。例如CHO细胞培养基、293细胞培养基、Vero细胞培养基、BHK21细胞培养基、MDCK细胞培养基、昆虫细胞培养基等等。

5.  按照产物表达工艺

(1)   稳定表达培养基

用于细胞培养和稳定表达目的蛋白的细胞培养基。

(2)   瞬时表达培养基

用于细胞培养和瞬时表达目的蛋白的细胞培养基。

6.  按照商品情况

(1)   商品培养基

指供应商目录中的商品细胞培养基品种。

(2)   客户定制培养基

根据用户配方要求为客户定制的细胞培养基。


四、细胞培养基的国际品牌

从21世纪起始,细胞培养基业务成为各大生物技术公司的猎取对象,经过近二十年的收购与整合,形成以下5家为主的拥有细胞培养基业务的跨国公司(排名不分先后)。

(1)   赛默飞世尔(Thermo Fisher)

赛默飞世尔通过两次收购,收购Hyclone和收购拥有Gibco的Life Technologies,成为细胞培养基业务的龙头。

(2)   德国默克(Merck)

德国默克先后收购清大天一和已经将JRH纳入怀中的Sigma-Aldrich,从无到有,跻身细胞培养基业务前列。

(3)   丹纳赫(Danaher)

同样从无到有,原GE生命科学通过收购PAA和从赛默飞世尔剥离出来的Hyclone细胞培养业务跻身细胞培养基前列。2020年,这些业务并入丹纳赫(Danaher)旗下。

(4)   龙沙(Lonza)

作为CDMO业务鼻祖的龙沙,具有很强的细胞株构建和细胞培养基研发能力,是细胞培养基业务家族的主要成员之一。

(5)   富士胶片(FUJIFILM)Irvine Scientific

富士胶片通过收购Irvine Scientific得以在细胞培养基业务中扮演重要角色。

随着中国生物制药市场的发展,一些跨国公司在中国设立了细胞培养基的分装、配制工厂。


五、细胞培养基在中国的发展

20世纪90年代中期,在疫苗行业发展的促进下,出现了上海康达、宜兴赛尔、徐州利富康等几家国内最早的细胞培养基企业,他们的产品主要是疫苗生产使用的MEM和M199等公开配方的经典细胞培养基。

2006年,成立两年的清大天一开发成功含有植物水解物的CHO细胞无动物来源成分无血清培养基,并在当时尚处于萌芽阶段的国内单抗工艺研发中得到应用;随后开发的无蛋白低血清细胞培养基在疫苗生产中得到应用。2008年借助于细胞培养基研发和细胞株驯化,成功开发我国第一家口蹄疫疫苗悬浮培养生产工艺并实现产业化;2010年成功开发世界上第一个无血清培养口蹄疫疫苗悬浮培养生产工艺并实现产业化。

由清大天一起草的,于2007年颁布实施的中华人民共和国化工行业标准《哺乳类动物细胞培养基(HG/T 3935—2007)》(Cell culture media)是迄今为止唯一的国家级细胞培养基标准。但该标准只规定了MEM、M199、DMEM等经典细胞培养基产品的质量标准和检测方法,在无血清细胞培养基、个性化细胞培养基快速发展的情况下,质量标准亟需更新。

2011年以后,国内细胞培养基企业如雨后春笋般诞生,发展成生物工艺的一个细分行业。细胞培养基产品和技术也快速发展,例如在单抗领域,国产细胞培养基连续培养CHO细胞取得很好的效果;在疫苗行业,继无血清全悬浮培养BHK-21细胞生产口蹄疫疫苗之后,无血清全悬浮培养MDCK细胞生产禽流感疫苗也成功投产。

有不少细胞培养基公司能够紧随和对标跨国公司的细胞培养基产品和技术,在细胞株开发、细胞培养基研发等方面具有较强的技术能力,同时具有工艺开发能力。例如多宁生物的细胞培养基研发、生产和细胞培养工艺开发平台,以丰富的细胞库、数据库和细胞培养工艺开发平台为基础,能够针对生物医药不同领域和产品需求,开发出适合的细胞培养基产品,同时为客户提供细胞培养工艺技术解决方案。[ZR6] [Z7]

这些公司的业务目标主要集中在具有想象空间的单抗药品生产和CDMO市场,同时产品也可以满足疫苗行业需求,据不完全统计,有(排名不分先后):多宁、健顺、奥浦迈、康晟、艾米能斯、倍谙基、臻格、迈邦、恺瑞等。另外,还有不少以疫苗业务为主的公司(排名不分先后):源培、天信和、沃美、百诺吉、金源康、壹生科、赛尔百灵、美迪、旭太、宏伟等。


六、对国内细胞培养基行业的思考

据上述不完全统计,国内的细胞培养基企业已近20家。2019年底,某国内细胞培养基企业二期工程动工,拟建立中国乃至全球产能最大的细胞培养基生产基地。当然,正在扩建中的细胞培养基企业并不仅这一家。

毫无疑问,国内细胞培养基的生产能力将远供大于求,市场竞争将越来越激烈。在这种发展现状和趋势下,以下几个问题值得业内企业和人士思考。

(1)   原料国产化

原料国产化对于以疫苗业务为主的细胞培养基公司来说早已不是问题,但目前业务重心在单抗行业的细胞培养基公司大多采用进口原料。合理的替代进口原料以降低产品成本是这些企业需要考虑的问题。

(2)   为用户降低成本

“4+7”带量采购迫使药品生产企业大幅度持续降低产品成本。一方面对于研发投资大、耗时长、附加值高的生物药来说,仅靠生产设备和耗材的价格优势并不足以替换进口产品,必须有满足客户需求的技术优势和个性化支持服务做为基础;另一方面替代并不代表一劳永逸,包括细胞培养基在内的生物工艺企业应该建立不断为用户增加价值、降低成本的策略,不仅针对单抗用户,也包括疫苗用户。

(3)   关注国内疫苗市场

对于那些聚焦单抗行业的细胞培养基公司来说,尽管有很好的市场预期,但也不应该忽视国内的疫苗市场需求。作为细胞培养基企业来说,只针对部分市场需求的业务是不全面的。通过细胞培养基原料国产化,并利用单独生产线或者能够防止交叉污染对单抗用培养基可能的影响,发挥自身技术优势帮助疫苗行业提高工艺水平,以取得更多的业务。

(4)   参与细胞治疗

包括免疫细胞、干细胞在内的细胞治疗和相关行业是具有数千亿美元预期的市场。细胞培养基作为必不可少的耗材,值得企业更多的关注和介入。

(5)   发展国际业务

业务国际化是企业持续发展的必由之路。细胞培养基行业目前的人才、技术、产能、质量、竞争等诸要素已经具备进入国际市场的基础。

(6)   发展定制液体培养基业务

制药一次性系统的不断发展和应用,对定制液体培养基也提出了需求。跨国公司已经先行,国内企业应该关注和适当跟进。



本文系笔者一家之言。由于对生物工艺行业了解有限,错误或疏漏在所难免,敬请业内专家和朋友们随时批评指正。欢迎各种形式的交流。谢谢!


下期预告:第一部分(附) 牛血清



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发表于 2021-1-20 08:30:11 | 显示全部楼层 |阅读模式

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