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生物咖啡茶

本文内容来自《蛋白纯化工程研究院》微信群成员于2020年4月3日上午讨论分享整理而成,仅供参考,为保护个人隐私,用Q,A代替讨论人员,谢谢。关于包涵体蛋白复性及纯化的经验心得及问题欢迎文章底部留言。

另需要加入《蛋白纯化工程研究院》微信群的,添加微信514099167,添加好友时备注姓名及工作学习单位,加好友后拉入交流群,谢谢。



Q:
咱们群里面有做过包涵体复性的同仁吗?使用透析方式进行复性,蛋白浓度,复性液以及复性温度有谁做过研究?

A:
我们都是稀释复性的,工业上复性主要是稀释法。


Q:
也尝试了稀释复性,但是蛋白都以聚集沉淀除去了,你们的复性液一般是什么?
我采用的复性液:50 mmol/L Tris-HCl,0.05%聚乙二醇(PEG)4000,5%甘油,0.1mM EDTA,100mMNaCl,0.01mMGSSG,pH8.0-8.5;将变性蛋白质稀释15-60倍,使变性剂浓度降低至蛋白质可以进行重折叠的程度,即缓慢的将变性包涵体蛋白滴加至烧杯折叠缓冲液中,同时剧烈搅拌以快速混匀。稀释过程在室温下进行,混合完成后,将溶液静置1-2小时以保证重折叠过程的完成,同时也使聚集物形成并出现絮凝物。

A:
我们没有PEG和甘油,具体的参数还得自己摸索。


Q:
处理方式是这样吗?

A:
透析复性也不适合工业放大啊,只能实验室搞搞。


Q:
稀释一般情况下终浓度保持在1-10ug/ml,对蛋白的回收率也是一种挑战。无论是哪种方法,感觉这就是一门学问,成功的概率存在偶然性。

A:
正确复性的如大海捞针。要不断优化,比如稀释法,缓冲液种类,离子强度,pH,添加剂,及添加量,滴加方式,搅拌速度,要系统得做试验优化。做个DOE。


Q:
包涵体或者分泌表达的层析方法大家可以分享交流一下。目前对这块儿比较感兴趣。

A:
好多年前的经验了:稀释复性是最经典的效果最好;氧化还原对和分子伴侣在实验室规模都还可以,不过不一定适合放大;透析损失是最大的;柱上复性感觉是纸上谈兵,至少以前做过的项目效果都不太理想。
柱上复性做研究可以,但工业上用的非常少,可能缺少工业成功案例,大家可以试试看,实验室即使做成功了,也面临着放大过程的很多问题。


Q:
变性蛋白所处环境若发生突变,即短时间内变性剂浓度的大幅度变化,会迫使蛋白在短时间内形成更紧凑的结构,容易发生错误折叠和聚集,那么这和稀释复性是存在矛盾的?

A:
有交集不矛盾。稀释复性,也可以尝试将复性液分阶段缓慢的加入到变性的蛋白溶液中,不剧烈,比如总稀释50倍,可以先加5倍体积,停止一段时间在加5倍体积。


Q:
前参考蛋白质纯化指南(美 R.R. 伯吉斯)通过稀释复性之后0.22μm的滤膜过滤重折叠蛋白质,然后将其上柱(SP离子交换层析柱),竟然不与柱料结合,但是我的天然蛋白是结合的,也是无解。

A:
做的是哪类的产品。还要注意一个问题,复性后蛋白的用途,生物医药和其它用途的蛋白对各种添加剂及各种物质限量的要求是完全不一样的。


Q:还有更奇怪的,偶然的一次通过透析复性搞出了活性,但是再重复就做不出来了,无比的奇怪。
A:
GSH/GSSG这两个有没有考虑添加,它们的配比是不是可以优化优化。


Q:
这个我也尝试了GSH/GSSG,没有搞出活性,我的感觉是越做越迷茫。

A:
包涵体复性是非常复杂的过程,要系统性的优化。



Q:尝试了精氨酸,PEG,甘油等,无功而返。
A:
浓度高也会影响。我这边就是高浓度出现聚集。。。浓度,表面活性剂都还在考虑。还有个问题,复性效率的监测。。PAGE是个方式。但是效率慢。目前浓度略低。。。还在摸索中。


Q:
更多包涵体蛋白纯化及复性问题请在文章底部留言。

A:
需要加入蛋白纯化工程研究院微信群的,加微信514099167(备注姓名及单位)

发表于 2020-6-2 10:54:50 | 显示全部楼层 |阅读模式

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