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生物咖啡茶

本帖最后由 千纯生物 于 2019-9-24 14:42 编辑

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写在前面
研究蛋白质首要的步骤是将目的蛋白从复杂的混合物中分离纯化出来,得到高纯度具有生物学活性的目的物。因此,高效的纯化技术和手段是蛋白质研究的重要基础和关键之一。

蛋白质是包括人类在内的各种生物有机体的重要组成成分,是生命的物质基础之一。生物体的生长、发育、遗传和繁殖等一切生命活动都离不开蛋白质。
随着分子生物学、结构生物学、基因组学等研究的不断深入,人们意识到仅仅依靠基因组的序列分析来试图阐明生命活动的现象和本质是远远不够的。只有从蛋白质组学的角度对所有蛋白质的总和进行研究,才能更科学地掌握生命现象和活动规律,更完善地揭示生命的本质。
由此许多学者将生命科学领域的研究焦点从基因转向蛋白质,使蛋白质成为揭示生命活动现象和分子生物学机理的重要研究对象。研究蛋白质首要的步骤是将目的蛋白从复杂的大分子混合物中分离纯化出来,得到高纯度具有生物学活性的目的物。因此,高效的纯化技术和手段是蛋白质研究的重要基础和关键之一。



蛋白提取纯化程序

分离纯化某一特定蛋白质的一般程序可以分为前处理、粗分离、精细分离三个步骤

01
前处理

分离纯化某种蛋白质,首先要把蛋白质从原来的组织或细胞中以溶解的状态释放出来并保持原来的天然状态,不丢失生物活性。
为此,动物材料应先剔除结缔组织和脂肪组织,种子材料应先去壳甚至去种皮以免受单宁等物质的污染,油料种子最好先用低沸点的有机溶剂如乙醚等脱脂。然后根据不同的情况,选择适当的方法,将组织和细胞破碎。

动物组织和细胞可用电动捣碎机或匀浆机破碎或用超声波处理破碎。植物组织和细胞一般需要用石英砂或玻璃粉和适当的提取液一起研磨的方法或用纤维素酶处理也能达到目的。细菌细胞的破碎比较麻烦,破碎细菌细胞壁的常用方法有超声波破碎,与砂研磨、高压挤压或溶菌酶处理等。
组织和细胞破碎后,选择适当的缓冲液把所要的蛋白提取出来。细胞碎片等不溶物用离心或过滤的方法除去。

如果所要的蛋白主要集中在某一细胞组分,如细胞核、染色体、核糖体或可溶性细胞质等,则可利用差速离心的方法将它们分开,收集该细胞组分作为下步纯化的材料。如果碰上所要蛋白是与细胞膜或膜质细胞器结合的,则必须利用超声波或去污剂使膜结构解聚,然后用适当介质提取。

02
粗分离
当蛋白质提取液(有时还杂有核酸、多糖之类)获得后,选用一套适当的方法,将所要的蛋白与其他杂蛋白分离开来。一般这一步的分离用超滤、盐析、等电点沉淀和有机溶剂分级分离等方法。这些方法的特点是简便、处理量大,既能除去大量杂质,又能浓缩蛋白溶液。

03
精细分离

样品经粗分级分离以后,一般体积较小,杂蛋白大部分已被除去。进一步纯化,一般使用层析法包括离子交换层析、亲和层析、疏水层析以及分子筛等。必要时还可选择电泳法,包括区带电泳、等电点聚焦等作为最后的纯化步骤。用于细分级分离的方法一般规模较小,但分辨率很高。
结晶是蛋白质分离纯化的最后步骤。尽管结晶过程并不能保证蛋白一定是均一的,但是只有某种蛋白在溶液中数量上占有优势时才能形成结晶。结晶过程本身也伴随着一定程度的纯化,而重结晶又可除去少量夹杂的蛋白。由于结晶过程中从未发现过变性蛋白,因此蛋白的结晶不仅是纯度的一个标志,也是断定制品处于天然状态的有力指标。



蛋白提取纯化方法


01
蛋白质(包括酶)的提取
大部分蛋白质都可溶于水、稀盐、稀酸或碱溶液,少数与脂类结合的蛋白质则溶于乙醇、丙酮、丁醇等有机溶剂中,因些,可采用不同溶剂提取分离和纯化蛋白质及酶。

(1)水溶液提取法
稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质最常用的溶剂,通常用量是原材料体积的1-5倍,提取时需要均匀的搅拌,以利于蛋白质的溶解。提取的温度要视有效成份性质而定。
一方面,多数蛋白质的溶解度随着温度的升高而增大,因此,温度高利于溶解,缩短提取时间。
但另一方面,温度升高会使蛋白质变性失活,因此,基于这一点考虑提取蛋白质和酶时一般采用低温(5度以下)操作。为了避免蛋白质提取过程中的降解,可加入蛋白水解酶抑制剂(如二异丙基氟磷酸,碘乙酸等)。

下面着重讨论提取液的pH值和盐浓度的选择:

a.pH值
蛋白质,酶是具有等电点的两性电解质,提取液的pH值应选择在偏离等电点两侧的pH 范围内。用稀酸或稀碱提取时,应防止过酸或过碱而引起蛋白质可解离基团发生变化,从而导致蛋白质构象的不可逆变化,一般来说,碱性蛋白质用偏酸性的提取液提取,而酸性蛋白质用偏碱性的提取液。

b.盐浓度
稀浓度可促进蛋白质的溶,称为盐溶作用。同时稀盐溶液因盐离子与蛋白质部分结合,具有保护蛋白质不易变性的优点,因此在提取液中加入少量NaCl等中性盐,一般以0.15摩尔。升浓度为宜。缓冲液常采用0.02-0.05M磷酸盐和碳酸盐等渗盐溶液。

(2)有机溶剂提取法
一些和脂质结合比较牢固或分子中非极性侧链较多的蛋白质和酶,不溶于水、稀盐溶液、稀酸或稀碱中,可用乙醇、丙酮和丁醇等有机溶剂,它们具的一定的亲水性,还有较强的亲脂性、是理想的提脂蛋白的提取液。但必须在低温下操作。
丁醇提取法对提取一些与脂质结合紧密的蛋白质和酶特别优越,一是因为丁醇亲脂性强,特别是溶解磷脂的能力强;二是丁醇兼具亲水性,在溶解度范围内(度为10%,40度为6.6%)不会引起酶的变性失活。另外,丁醇提取法的pH及温度选择范围较广,也适用于动植物及微生物材料。

02
蛋白质的分离纯化
根据蛋白质溶解度不同的分离方法
(1)蛋白质的盐析
中性盐对蛋白质的溶解度有显著影响,一般在低盐浓度下随着盐浓度升高,蛋白质的溶解度增加,此称盐溶;当盐浓度继续升高时,蛋白质的溶解度不同程度下降并先后析出,这种现象称盐析,将大量盐加到蛋白质溶液中,高浓度的盐离子(如硫酸铵的SO4和NH4)有很强的水化力,可夺取蛋白质分子的水化层,使之“失水”,于是蛋白质胶粒凝结并沉淀析出。
盐析时若溶液pH在蛋白质等电点则效果更好。由于各种蛋白质分子颗粒大小、亲水程度不同,故盐析所需的盐浓度也不一样,因此调节混合蛋白质溶液中的中性盐浓度可使各种蛋白质分段沉淀。

影响盐析的因素有:
(a)温度:除对温度敏感的蛋白质在低温(4度)操作外,一般可在室温中进行。一般温度低蛋白质溶介度降低。但有的蛋白质(如血红蛋白、肌红蛋白、清蛋白)在较高的温度(25度)比0度时溶解度低,更容易盐析。
(b)pH值:大多数蛋白质在等电点时在浓盐溶液中的溶解度最低。
(c)蛋白质浓度:蛋白质浓度高时,欲分离的蛋白质常常夹杂着其他蛋白质地一起沉淀出来(共沉现象)。因此在盐析前血清要加等量生理盐水稀释,使蛋白质含量在2.5-3.0%。

蛋白质盐析常用的中性盐,主要有硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠等。 其中应用最多的硫酸铵;另外硫酸铵分段盐析效果也比其他盐好,不易引起蛋白质变性。

蛋白质在用盐析沉淀分离后,需要将蛋白质中的盐除去,常用的办法是透析,即把蛋白质溶液装入秀析袋内(常用的是玻璃纸),用缓冲液进行透析,并不断的更换缓冲液,因透析所需时间较长,所以最好在低温中进行。此外也可用葡萄糖凝胶G-25或G-50过柱的办法除盐,所用的时间就比较短。

(2)等电点沉淀法
蛋白质在静电状态时颗粒之间的静电斥力最小,因而溶解度也最小,各种蛋白质的等电点有差别,可利用调节溶液的pH达到某一蛋白质的等电点使之沉淀,但此法很少单独使用,可与盐析法结合用。

(3)低温有机溶剂沉淀法
用与水可混溶的有机溶剂,甲醇,乙醇或丙酮,可使多数蛋白质溶解度降低并析出,此法分辨力比盐析高,但蛋白质较易变性,应在低温下进行。

根据蛋白质分子大小的差别的分离方法
(1)透析与超滤
透析法是利用半透膜将分子大小不同的蛋白质分开。
超滤法是利用高压力或离心力,强使水和其他小的溶质分子通过半透膜,而蛋白质留在膜上,可选择不同孔径的泸膜截留不同分子量的蛋白质。

(2)凝胶过滤法
也称分子排阻层析或分子筛层析,这是根据分子大小分离蛋白质混合物最有效的方法之一。柱中最常用的填充材料是葡萄糖凝胶(Sephadex ged)和琼脂糖凝胶(Purose  6 Fast Flow  )。



根据蛋白质带电性质进行分离
蛋白质在不同pH环境中带电性质和电荷数量不同,可将其分开。

(1)电泳法
各种蛋白质在同一pH条件下,因分子量和电荷数量不同而在电场中的迁移率不同而得以分开。值得重视的是等电聚焦电泳,这是利用一种两性电解质作为载体,电泳时两性电解质形成一个由正极到负极逐渐增加的pH梯度,当带一定电荷的蛋白质在其中泳动时,到达各自等电点的pH位置就停止,此法可用于分析和制备各种蛋白质。

(2)离子交换层析法
离子交换剂有阳离子交换剂(如:SP Purose® 6 Fast Flow)和阴离子交换剂(Q Purose® 6 Fast Flow),当被分离的蛋白质溶液流经离子交换层析柱时,带有与离子交换剂相反电荷的蛋白质被吸附在离子交换剂上,随后用改变pH或离子强度办法将吸附的蛋白质洗脱下来。

根据配体特异性的分离方法-亲和层析法
亲和层析法(aflinity chromatography)是分离蛋白质的一种极为有效的方法,它经常只需经过一步处理即可使某种待提纯的蛋白质从很复杂的蛋白质混合物中分离出来,而且纯度很高。这种方法是根据某些蛋白质与另一种称为配体(Ligand)的分子能特异而非共价地结合。


蛋白提取纯化注意事项

在进行任何一种蛋白质纯化的时候,都要时刻注意维护它的稳定性,保护它的活性,有一些通用的注意事项需要牢记,它们包括:
1、操作尽可能置于冰上或者在冷库内进行。
2、不要太稀,蛋白浓度维持在μg/mL~mg/mL。
3、合适的pH,除非是进行聚焦层析,所使用的缓冲溶液pH避免与pI相同,防止蛋白质的沉淀。
4、使用蛋白酶抑制剂,防止蛋白酶对目标蛋白的降解;在纯化细胞中的蛋白质时,加入DNA酶,降解DNA,防止DNA对蛋白的污染。
5、避免样品反复冻融和剧烈搅动,以防蛋白质的变性。
6、缓冲溶液成分尽量模拟细胞内环境。
7、在缓冲溶液中加入0.1~1mmol/LDTT(二硫苏糖醇)(或β-巯基乙醇),防止蛋白质的氧化。
8、加1~10mmol/LEDTA金属螯合剂,防止重金属对目标蛋白的破坏。
9、使用灭菌溶液,防止微生物生长。


提取纯化常见问题

1、蛋白纯化标签应该如何选择?
答:在进行蛋白表达时,选择合适的标签有利于蛋白的纯化,促进蛋白的可溶性,因此了解几种常用的蛋白纯化标签很重要。
一般来说,常用的蛋白纯化标签主要有His tag、GST tag、MBP tag、NusA tag、Strep tag,那么这些蛋白纯化标签有什么不同之处呢?
His tag(组氨酸标签)融合蛋白是目前最常见的表达方式,其优点是标签小,纯化步骤简便,纯化条件温和,能纯化可溶性/包涵体蛋白,一般不会影响蛋白的功能结构,且可以产出大量的目标蛋白,但该标签不适合易氧化蛋白或膜蛋白的纯化。(可选用千纯生物Ni-NTA Purose® 6 Fast Flow填料纯化)

GST tag(谷胱甘肽巯基转移酶)的洗脱条件温和,有助于保持蛋白功能活性,适合pull-down 检测,具有很好的线性动态范围,但分子量较大,可能会影响蛋白质的功能和下游实验,如果蛋白不可溶,很难用变性的方法进行纯化。(可选用千纯生物GSH Purose® 4 Fast Flow填料纯化)


MBP tag(麦芽糖结合蛋白标签)可以减少目标蛋白的降解,增加蛋白的表达量和稳定性,提高表达产物的水溶性,但标签较大,对蛋白的结构和功能会有一定影响。
NusA tag(转录终止/抗终止蛋白标签)不具有独立的纯化标签功能,需要和其他标签(如His标签)联用,可提高蛋白质的溶解性,但由于分子量较大,对蛋白下游应用会有影响。
Strep tag(strep标签)能产出高纯度(95%)的目标蛋白,且能保持目标蛋白活性,主要是因其纯化流程温和。其次,能进行变性条件下的纯化。在用于WB/ELISA,可侦测目标蛋白。另外,还可固定目标蛋白,检测蛋白质交互作用,或更进一步用以筛选治疗用蛋白质,或是工业用酵素。但Strep tag纯化系统的价格相对His tag而言较高,所产出的目标蛋白数相对较少。


2.利用疏水性质,用反向 HPLC 方法分离的原理?
答:反相和疏水都是依据物质的极性来纯化的,极性越强先出来,极性越弱越后出,洗脱疏水是高盐吸附低盐洗脱,反像是极性强的流动相吸附,降低它的极性洗脱,选择主要是依据填料的特点以及样品本身的特点而改变的。
疏水的填料疏水集团密度只是反相的 10%左右,其他的都是亲水的,而反相正好相反,它的表面全是疏水基团,因此疏水一般需要高盐吸附,低盐洗脱,反相一般用甲醇水乙睛水吸附,洗脱是逐渐增加有机溶剂的量.由于以上的原因,疏水比反相要温和,蛋白一般不变性,由于填料多为琼脂糖凝胶,所以蛋白回收率高,而反相适合做分析多,也有做制备的,那也是一些分子量相对小的多肽,反相的回收率也低, 因为硅胶杂吸附的原因.疏水色谱是纯化蛋白的另一个有力的工具.

3.重组蛋白A琼脂糖凝胶 FF 能一次纯化大量血清 IgG 吗?如几十毫升,如用环氧活化的琼脂糖凝胶纯化血清 IgG,先要偶联其相应配基如抗体或蛋白 A 是吗?这里琼脂糖凝胶用环氧活化的意义是什么?
答:几十毫升如果一次纯化也就用几十毫升的 重组蛋白 A 琼脂糖凝胶 FF 就可以,也可以分两三次纯化,这都没有问题,如果是你想做血清中的抗体纯化也可以把抗原偶联到环氧活化琼脂糖凝胶上, 这样得到的抗体更纯, 一般不选择蛋白 A, 环氧活化便宜,而且相成的键很稳定,没有非特异吸附,是个不错的方法.(可选用千纯生物iProtein A Purose® 4 Fast Flow或者NHS Purose® 4 Fast Flow填料进行纯化)


4. 通过 His 标签纯化的蛋白,杂带比较多,如何改进?
答:(1)如果纯化的是上清,蛋白酶会部分降解目的蛋白,可通过加多种蛋白酶抑制剂改进。
(2)可提高杂蛋白与镍柱结合起始咪唑浓度,以降低杂蛋白与镍柱的亲和力。
(3)杂蛋白和目的蛋白结合,可通过超声前加入去垢剂的方式消除(1%-2%Tritonx-100)。

5. 镍柱使用中出现棕色是怎么回事?
答:出现这样的情况,主要是缓冲液中 DTT 的影响,DTT 会对镍柱的颜色和纯化效率有很大的影响,在碱性的缓冲液条件下镍离子会被 DTT 还原生成棕色的沉淀,所以所有镍柱的生产商都强调要尽量避免 DTT 的参与(一般的镍柱耐受小于 5mM DTT,推荐缓冲液中不要超 2mM DTT)。此种情况强烈建议使用千纯生物超耐受的Ni-TED Purose® 4 Fast Flow,可以耐受纯化体系中的DTT和EDTA,还可以直接使用1M氢氧化钠清洗,无需脱Ni再生

6. 镍柱堵了怎么办?
答:(1)柱子发生堵塞,可能是样品中细胞碎片或其他杂颗粒所致,所以样品一定要高速离心,并过0.22或者0.45的膜
(2)上清纯化时,蛋白发生变性,有絮状物产生,赶紧加入 1-2mM DTT (上清样品处理要在冰浴中进行),还不行加尿素变性,使其在变形环境下。
(3)样品处理时的料液比不要太小,否则黏度大,或者导致蛋白析出或变性,料液比要在 1/10-1/15 之间较适宜。

7. 纯化过程中,蛋白出现了浑浊,怎么办?
(1)出现浑浊,说明蛋白处在不稳定的环境中或者自身就不稳定,所以要检查缓冲体系是否正确,环境是否低温,或在缓冲液中加入还原剂 DTT。
(2)加入肌氨酸钠,迅速使蛋白变性,消除浑浊现象。

8. 没能纯化到带 His 标签的蛋白,蛋白都流穿了(未挂柱)?
(1)超声的功率不对(太大,蛋白炭化,太小,蛋白没有释放)
策略:改变超声功率,并在超声前加入溶菌酶。
(2)样品或者是结合缓冲液不正确 ;
策略:检测 pH 及样品和结合缓冲液的组成份。
(3)组氨酸的标签没有完全的暴露 ;
策略:在变性条件下(用 8M 脲,6M 盐酸胍,1%SDS) 并加入 1-2mMDTT 进行纯化。
(4)His 标签丢失;
策略 1:WB 或者 anti-his 的抗体检查 His 是否表达,上游构建,改变 his-tag 的位(C-terminal orN-terminal),必要时增加 his 个数(常用 6-10 个);
策略 2:孵育的时间不够,降低流速和增加孵育的时间;
策略 3:改变螯合的金属离子,寻找到最佳的结合金属离子。
Ni2+通常是从宿主细胞蛋白中纯化大多数(组氨酸)6 标记的重组蛋白质的首选金属离子,也是一般最常用的离子。
蛋白和金属离子之间的结合强度受几种因素影响,包括长度、位置、亲和标记在蛋白的暴露程度、所用离子的类型、以及缓冲液的 pH,因此一些蛋白用其他离子可能更容易地进行纯化而不用 Ni2+。可以利用 Hitrap IMACHP 来筛选不同的金属离子。

9. 蛋白挂在柱子上洗脱不下来,怎么解决?
答:(1)洗脱条件太温和(组氨酸标记的蛋白质仍然结合在柱上,结合力较强) 策略:用增加咪唑的梯度洗脱或降低pH 来找出最佳的洗脱条件。
(2)降低 PH 的方法洗脱的,因为若 PH 低于 3.5,会导致镍离子脱落策略:改变洗脱办法,咪唑竞争性洗脱。
(3)蛋白已沉淀在柱上策略:减少上样量和孵育的时间,试用去污剂(1%-2%Tritonx-100)或改变 NaCl 的浓度,或在变性条件下洗脱(用 8M 脲,或 6M 盐酸胍),最终也可在洗脱 Buffer 中加入 2mMDTT 或者 0.5%肌氨酸钠进行洗脱。
(4)非特异性疏水或其他相互反应策略:加非离子去污剂到洗脱缓冲液(如,2%Triton X-100)或增加 NaCl 的浓度。

10. 如何处理样品,可使其初步提纯(如何洗去蛋白的自身带)?
答:(1)上清样品处理,要加入去污剂,蛋白酶抑制剂,还原剂,还要注意温度及超声破碎的参数。
(2)去大肠杆菌自身带(两条 30KD-40KD)可用非变性缓冲液超声悬浮(加入去垢剂),离心 6000r/min,30min,10℃。(若效果不够可继续上述步骤)。
(3)大肠杆菌包涵体的洗涤,可用包涵体洗液多洗几遍,也可用 1M/2M/4M/8M 尿素逐步溶解,可选取其中纯度最佳的。
(4)可用硫酸铵沉淀法,初步提纯。



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发表于 2019-9-24 14:26:29 | 显示全部楼层 |阅读模式

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