请选择 进入手机版 | 继续访问电脑版

生物咖啡茶

蛋白纯化手册
(蛋白纯化技术汇总第四版)
已发布,点击下面蓝色字体查看
更多内容关注下面公众号
qrcode_for_gh_021c72a4f280_258.jpg
介质寿命的界定
     
      层析介质寿命的界定通常指在特定工艺条件下使用过程中,从开始使用到使用时与设定的工艺指标发生偏差的使用次数。层析介质用途广泛,在生物制品,血液制品,疫苗,生物制药,日化,医疗器械等领域用做纯化生物大分子或者固定化合物。

     不同应用领域或不同应用方式对寿命的界定完全不同。在生物制药或生物制品行业用来纯化生物大分子时,寿命通常与cGMP或FDA等法规要求的工艺安全性,稳定性及有效性有关,当使用层析介质的过程中,工艺过程指标发生偏差时寿命就到期了。

     层析介质用在医疗器械行业用于固定化合物时,通常没有寿命一说,更多的是固定化合物之后的一个保质期或有效期。

     抛开工艺过程谈层析介质的寿命没有任何意义。层析介质的载量,流速是评价其品质的主要指标,寿命并非层析介质的一个指标,结合使用时的工艺指标及载量,流速可以判定介质的使用寿命,也就是说使用寿命可以用载量,流速的变化来表征。

介质寿命认知误区
     
       1.介质的寿命是使用过程中呈现的,并非介质性能指标。
       2.在界定介质寿命时,首先要明确使用的属性,确立判断指标,比如纯化生物大分子时纯度及收率的偏差范围等。
      3.介质寿命都是基于一个特定的工艺过程和目的导向,不同的工艺过程寿命的判断标准及界定有所差异。如纯化生物大分子时主要考虑其收率及纯度偏差,用于去除内毒素或者HCP时主要考虑其去除率的偏差。

介质寿命的验证

     

      层析介质的寿命界定是通过使用过程工艺指标的偏差去判断的,那么验证寿命就是使用过程偏差发生之前的使用过程的积累。验证是通过小试实验数据的积累统计分析去完成的。


寿命验证小试验证实验设计:
     小试验证实验是为中试及生产提供可靠的依据,在设计小试实验时,就要明确层析过程线性放大的各种因素及对层析过程有影响的各种因素,综合层析过程放大因素及层析过程影响因素来设计小试验证实验。

【层析过程放大因素】
       1)须保持一致的因素:柱床高度,层析柱及层析系统类型,线性流速,样品状态及属性,层析过程(平衡,清洗,洗脱体积数及缓冲液种类),清洗试剂的种类及清洗过程,柱效。
        2)可线性放大因素:体积流速,柱床体积。

【层析过程影响因素】
       环境温度对层析过程有一定影响,特别在疏水层析过程中,环境因素对层析过程影想较大。
       环境洁净程度对层析过程,特别是精纯阶段及去内毒素时影响很大。
      人为因素,最难控的因素对层析过程的影响也很大。建立SOP及有效可靠的过程监控方法是避免人为因素对层析过程的稳定可靠的一种方式。

【寿命验证小试实验设计】
       1)在设计小试验证实验时需保证层析过程放大因素和中试及生产规模保持一致的因素完全一致,可根据层析过程中的可线性方大因素设计试验规模及层析柱和层析系统的选型。
        2)避免层析过程影响因素对结果的影响。设计小试实验室必须在生产所要求的环境温度及洁净车间进行,并且严格执行过程SOP,且要对过程进行可靠的监管。

介质的保养及维护
     
     层析介质的寿命影响因素有:
     1)介质纯化的物料的洁净程度,物料越洁净使用寿命越长。
     2)  工艺阶段,用在精纯阶段通常比用在捕获阶段的寿命要长。
     3)层析系统及层析柱密封性及和介质接触部件材质对介质寿命有一定影响,密封差容易长菌简短使用寿命,接触介质的部位及物料的部分的兼容性,兼容性越好对介质寿命影响越小。
     4)层析介质的装填方法及贮存方式对其寿命也有影响。
     5)介质的保养及维护,保养维护对介质的使用寿命影响非常大。
介质的维护
     层析介质的维护是层析介质寿命的关键影响因素。层析介质在使用过程,物料和其接触后,洗脱之后,残留的蛋白,核酸,内毒素,色素及缓冲液中的杂质也污染了介质,这些污染物不仅影响介质的性能,也会污染目标产品,通过再生,清洗及消毒的方式去除这些污染的过程通称为介质的维护。

1.再生
恢复介质的原有功能,每使用一个循环后进行。
*离子交换介质用2M氯化钠流经柱床2个CV即可达到再生的目的。
*Ni Focurose 6FF IMAC介质的再生通常需要用1M的咪唑加1M的氯化钠进行再生,同样也流经柱床2CV.
*疏水层析介质通常用纯水或低浓度的缓冲液进行再生。
*凝胶过滤介质通常用2M氯化钠再生。

2.清洗(CIP):
去除再生没有去除的杂质及介质中积累的污染物,所以清洗过程比再生过程往往要剧烈,清洗要根据层析介质的类型耐受性,物料的性质,层析介质所处的工艺阶段,层析柱及层析系统的耐受性等综合考虑清洗的状态,通常使用1-10个循环清洗一次,同时要选择合适的清洗试剂。

通过试验证明清洗有效且污染物的残留及清洗试剂残留已经降低到安全水平的工作就是清洗验证。清洗验证可通过检测载量,流速及清洗试剂残留的方式去验证。因此不同的工艺过程,介质的清洗有不同的操作模式和方法,清洗验证是整个目标物制备工艺中的一部分。

3.消毒:
层析介质的消毒主要作用是去除层析介质中的微生物以及内毒素等有害物质。每一批物料处理完后都要对介质进行消毒。常用的消毒方式是使用0.5-1M的氢氧化钠和介质接触30-60min。特别注意,部分介质不耐受氢氧化钠或者只耐受低浓度的氢氧化钠,如Protein G Focurose 4FF介质不耐受氢氧化钠,此时就要选择其它方式,比如用70%的乙醇进行消毒等。另外消毒过程往往会和清洗过程重合,消毒也可作为清洗的一部分。

4.保存:
a.未使用的层析介质通常都是保存在20%的乙醇中,常温保存(4-35度),亲和介质有一部分需要在4度保存。
b.装填在层析柱的介质保存,需要保存在湿度小洁净的环境中(建议万级),常用10mM的氢氧化纳作为保存剂,亲和介质用20%乙醇作为保存剂。
介质的清洗验证
    去除再生没有去除的杂质及介质中积累的污染物即清洗(CIP),所以清洗过程比再生过程往往要剧烈,清洗要根据层析介质的类型耐受性,物料的性质,层析介质所处的工艺阶段,层析柱及层析系统的耐受性等综合考虑清洗的状态,通常使用1-10个循环清洗一次,同时要选择合适的清洗试剂。

    通过试验证明清洗有效且污染物的残留及清洗试剂残留已经降低到安全水平的工作就是清洗验证。清洗验证可通过检测载量,流速及清洗试剂残留的方式去验证。因此不同的工艺过程,介质的清洗有不同的操作模式和方法,清洗验证是整个目标物质制备工艺中的一部分。

介质清洗的依据
     清洗过程通常都要涉及到高盐,酸碱及有机溶剂,相对都是比较剧烈的条件,剧烈的条件对层析介质的性能都会有一定的影响,那么我们如何确定介质是否需要进行清洗及何时清洗呢?
   
    在寿命验证过程中,当介质使用后和设定的工艺目标发生偏差时就要开始清洗,也就是说,在我们寿命验证的小试实验中,我们就要使用多少个循化后要开始清洗,以及如何清洗。清洗是工艺过程的一部分,与工艺过程有密切关系。

介质清洗方式
     清洗是去除再生没有去除的污染物,那么我们就要了解污染物的来源,污染物与物料及工艺阶段,工艺过程联系紧密。
      1)捕获阶段,物料通常比较复杂,含有大量的杂质,色素,内素素等,再生往往难以去除干净,那么待清洗去除的物质也很复杂,清洗过程也很复杂,可能需要多种模式配合作用,同时清洗的频率和强度都要高。通常使用1个循环后就要清洗一次。

        2)中度纯化阶段,物料已经去除了大部分杂质,通过再生残留在介质上的污染物就很少了,清洗过程和频率比捕获阶段就要低很多。使用5-10个循环后就需要清洗一次。

        3)精纯阶段,物料已很纯净,只含有微量的杂质,再生通常就可以达到清洗的目的,此时清洗的频率和强度就更低。根据小试确定的清洗需要开始的状态进行清洗。

介质清洗方法
     不同的介质及不同的污染物清洗方法不同,清洗纪要保证清洗效果同时要减少对层析介质的损伤,还要避免清洗试剂对介质的二次污染,选择合适的清洗方法非常重要。依据层析介质的污染物的种类进行清洗方法,下面分别介绍不同污染物清洗方法的选择。
1可溶性杂蛋白的清洗
可溶杂蛋白主要是HCP,可溶性杂蛋白主要是由介质的非特异性吸附或者洗脱强度过低引起的,这个在我们再生的时候通常已经去除干净,若介质被可溶性杂蛋白污染,再生和清洗的过程往往可以合并为一步。

1)离子交换介质用2M的氯化钠洗1-2CV,接触时间控制在15-30min,若清洗完保存,则需要用10mM氢氧化钠或者20%的乙醇流经柱床即可。
2)疏水层析被可溶性蛋白污染时,可用低浓度缓冲或者超纯水,或者30%的异丙醇清洗2-3CV即可,
3)凝胶过滤介质被可溶性杂蛋白污染时,可用2M的氯化钠或者0.1-0.5M的氢氧化钠清洗1CV即可。
4)亲和层析被可溶性蛋白污染时,清洗要一句亲和层析的类型进行选择。

层析介质被可溶性蛋白污染时清洗过程可和再生过程合二为一同时进行。
2固化的蛋白(沉淀或聚集)的清洗
固化在介质中的蛋白,是介质在使用的过程中,蛋白变性后沉淀在介质,也有可能是介质使用时介质中高密度蛋白聚集而成沉淀(这与物料的性质有关)。固化在介质中的蛋白严重影响介质的性能,要及时清洗。
1)凝胶过滤介质,疏水介质,离子交换介质通常都可以通过0.5-1M的氢氧化钠进行清洗1-2CV即可,清洗完后要立即用水清洗到中性。
2)亲和介质的种类多,亲和介质被沉淀的蛋白污染时要依据亲和介质的种类及耐受性选择合适的清洗方法,部分可通过尿素或等蛋白变性剂清洗1-2CV.
3疏水性蛋白的清洗疏水性蛋白污染介质时,离子交换介质,疏水介质,凝胶过滤介质用3-4M的氢氧化钠清洗3-4CV,然后立即用水洗到中性。亲和层析介质则要根据其种类选择合适的方法清洗。4脂类物质的清洗用0.5%的Triton X-100等非离子型去污剂清洗3-4CV,或者30%异丙醇及70%乙醇清洗3-4CV.5核酸的清洗用1M氯化钠加1M氢氧化钠清洗1-2CV,亲和层析介质需要摸索清洗方法。6色素的清洗色素是一类物质,不同来源的色素的清洗过程差异较大,可根据介质的性质及色素的性质进行清洗,碱洗,酸洗,有机溶剂,及去污剂,变性剂都可以尝试。7内毒素及微生物的清洗内素素及微生物的清洗通常用0.5-1M的氢氧化钠清洗1-2CV之后,在用超纯水冲洗至中性。亲和层析介质可通过0.5%的非离子型去污剂及有机溶剂的方式清洗内毒素。
清洗过程注意事项:
1)清洗过程要综合考虑污染物的类型及介质的种类,清洗的同时要减少对介质的损伤。
2)清洗时通常需要多种方法组合使用,清洗过程并非是固定不变的。
3)清洗试剂应选择纯度高的试剂,避免二次污染。
4)清洗之后要立即洗到中性保存。
5)清洗状态的确定及方法的确定要结合整个工艺过程。
6)清洗之后要对清洗过程进行验证,保证清洗目的实现,可通过测定载量,流速等介质的性能指标验证。
生物制药合伙人《生物制药合伙人:zpt_Partner》公众号!秉持分享传承生物制药相关技术,汇集生物制药相关的细分技术,网罗业界同仁的丰富经验心得,助力行业的发展,以疫苗,抗体,蛋白等生物制药,生物技术的核心技术分享传承为初衷,助力行业发展。欢迎您把此公众号分享给自己的同学,同事,朋友!
谢谢。您有任何问题都可以加微信514099167交流,谢谢。
发表于 2018-10-26 11:07:35 | 显示全部楼层 |阅读模式

回复 | 使用道具 举报

该帖共收到 0 条回复!
您需要登录后才可以回帖 登录 | 立即注册  

本版积分规则

北京好思康科技有限公司版权所?

进入手机版 | 生物咖啡?/a> ( 京ICP备17071189号-1 )
2021-08-06 08:29:55

快速回复 返回顶部 返回列表