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生物咖啡茶

猪圆环疫苗纯化工艺的初探
易国军
武汉汇研生物科技股份有限公司
摘要
    国内绝大部分动物疫苗都是灭活、减毒或无毒的病原体疫苗(第一代动物疫苗),灭活、减毒或无毒的病原体疫苗因为残留大量的病原体及其碎片、HCP、DNA片段而导致免疫后动物出现不同程度的不良反应,而且疫苗免疫原性和反应原性较低。面对上述动物免疫后出现的不良反应,均采用基因改造、更换表达系统、添加蛋白标签来提高产量、纯度,从侧面降低副反应。而这些方式所达到的效果均不显著,而且这三种方法会涉及到生产工艺的变更和疫苗免疫原性和反应原性不同程度的降低。

猪圆环疫苗现状
     猪圆环病毒疫苗(porcine circovirusPCV)有两个血清型PCV-1PCV-2,其中PCV-1为非致病性的病毒,PCV-2为致病性的病毒,是断奶仔猪多系统衰竭综合征(Postweaning Multisystemic Wasting Syndrome,PMWS)的主要病原。
近年来,随着动物疫苗在疾病预防中的地位日益重要,很多企业把研究力量投入到新的疫苗生产工艺上,对疫苗质量要求也日益提高。猪圆环疫苗评价指标中,除抗原含量外,应激反应是另一重要指标。猪圆环疫苗之所以存在应激反应,是因为现有生产工艺在获得PCV2抗原的同时,不可避免地伴生了大量异源的与猪圆环病毒免疫无关物质(占比99%以上)。通过分离纯化的猪圆环病毒疫苗,不仅可以浓缩提高抗原含量,使抗体效价显著提升,抗体高峰期提前,还能大幅去除非抗原蛋白,降低应激反应。
猪圆环疫苗的生产方式主要为灭活疫苗和基因工程苗。不同生产方式的疫苗,所需纯化的工艺也不同。国内猪圆环疫苗种类、毒株、生产企业名录详见表1

1:国内猪圆环疫苗种类、毒株、生产企业名录
疫苗种类
毒株
生产企业

猪圆环病毒2型
基因工程苗
CP08
武汉中博、金宇生物


猪圆环病毒2型
灭活疫苗
SH
江苏南农高科、普莱柯、吉林正业
LG
哈尔滨维科生物、海利生物
WH
广东永顺、武汉中博、武汉科前、中牧股份、南京天邦
ZJ/C
齐鲁动保、浙江诺倍威、瑞普生物、四川华派、浙江荐量
DBN-SX07
大北农、成都天邦、山东华宏
YZ
金宇生物
资料来源:长江证券研究所研究报告

灭活疫苗的纯化工艺
    灭活疫苗多采用微载体悬浮培养的方式来获得高滴度病毒,灭活疫苗的生产方式得到全病毒颗粒,根据病毒颗粒与杂质分子量的差异,采用4FF或6FF等凝胶过滤介质进行组分分离,病毒颗粒经过层析柱外水体积(层析填料微球之间的孔隙,路径短)先流出,而蛋白质和核酸经过层析柱内水体积(层析填料微球内部的孔径,路径长)后流出,从而达到分离目的。该纯化工艺的回收率超过70%,缺点是层析填料用量大,上样量不能超过层析填料体积的30%,纯化效率较低。产品参数详见表2。

2:4FF、6FF产品相关参数(凝胶过滤系列)
产品名称
粒径(um)
排阻限(球蛋白)
线性流速(cm/h)
操作耐压(MPa)
高温高压(水中)
汇琼凝4FF
45-165
3×107
300-600
0.3
121℃,20min
汇琼凝6FF
45-165
4×106
250-600
0.3
121℃,20min


基因工程苗的纯化工艺
PCV-2含有两个功能性的开放阅读框(ORF),其中ORF2编码Cap蛋白是猪圆环病毒的主要结构蛋白,可自我装配成病毒性粒子,并含有可中和病毒的抗原表位,可诱导机体产生较强的抗体反应并获得免疫保护,是设计猪圆环疫苗的首选目标基因。

1、原核表达的纯化工艺
在原核表达中,应用较广的是通过将PCV-2ORF2基因(Cap蛋白)插入大肠杆菌原核载体中,利用大肠杆菌进行PCV-2Cap蛋白与组氨酸(His标签)融合表达,获得含His标签的Cap蛋白,制备亚单位疫苗。
原核表达生产方式得到含有组氨酸(His标签)的蛋白,根据蛋白质侧链上的组氨酸(His标签)对Ni2+等金属离子有高选择的特异性,采用Ni-6FF的亲和层析介质进行分离纯化,由于不同的螯合配基与Ni上的6个原子键结合数量不一样,故Ni-6FF分为3种类型:IDA3个原子键结合配基,3个原子键结合蛋白;IMAC4个原子键结合配基,2个原子键结合蛋白;TED5个原子键结合配基,1个原子键结合蛋白。该纯化工艺的回收率和纯度是最高的,缺点是原核表达容易出现包涵体,需要加入尿素或盐酸胍将包涵体进行溶解后纯化,然后将纯化得到的蛋白进行复性来提高疫苗效果,蛋白复性的难度较大,操作也较为繁琐。产品参数详见表3。

3:Ni-6FF产品相关参数(亲和层析系列)
产品名称
结合
能力
粒径  (um)
蛋白载量
(mg/ml)
线性流速
(cm/h)
特点
汇琼亲Ni-6FF(IDA)
45-165
40-50
300-600
不耐受还原剂及螯合剂
汇琼亲Ni-6FF(IMAC)
45-165
45
300-600
耐受低浓度还原剂和螯合剂
汇琼亲Ni-6FF(TED)
45-165
20-30
150-600
耐受高浓度还原剂、螯合剂及强碱

2、真核表达的纯化工艺
在真核表达中,应用较广的是通过将PCV-2ORF2基因(Cap蛋白)插入到昆虫杆状病毒,用昆虫细胞培养,获得重组的PCV-2Cap蛋白,制备亚单位疫苗,目前昆虫杆状病毒表达Cap蛋白制备的基因工程亚单位疫苗已实现商业化应用,故详述该纯化工艺的商业化应用。
真核表达生产方式得到不含标签的蛋白,根据蛋白的等电点(pI)在不同pH条件下所带电荷种类不同,采用Q-HPRSP-HPR通过配基所带相反电荷进行异性电荷相吸。蛋白缓冲液中pHpI,蛋白带负电荷,选用Q-HPR强阴离子交换介质;蛋白缓冲液中pHpI,蛋白带正电荷,选用SP-HPR强阳离子交换介质。昆虫杆状病毒表达系统使用的培养基等原材料成本非常昂贵,为降低纯化工艺中的损失,回收率成为纯化工艺要求最主要的指标。产品参数详见表4。

4Q-HPRSP-HPR产品相关参数(离子交换系列)
产品名称
粒径
um
离子载量(umol/ml
功能载量
mg/ml
线性流速
cm/h
操作耐压
MPa
汇琼离Q-HPR
25-45
180-250Cl-)
120HSA
300-400
0.5
汇琼离SP-HPR
25-45
180-280H+)
100Lysozyme
300-400
0.5


应用数据

1、纯化图谱

图1

图1


2、纯度检测
图片2.png
2  SDS-PAGE电泳图


图片3.png

3  纯化前后外观差异显著


5:纯化前后样品信息
        检测指标
纯化前后
纯度(%
抗原含量(μg/ml)
外观
应激反应
颜色
可见杂质
纯化前
40%
90-100
黄色浑浊
细胞碎片可见
反应剧烈
纯化后
85%
500
透明
较低
纯化后回收率:75-85%


发展方向

传统疫苗的生产工艺中,仅通过离心、过滤和沉淀技术等手段进行简易的分离,现将离心、过滤、层析等方法的有力结合,逐渐成为动物疫苗分离纯化的主流,应用先进的浓缩和分离纯化技术是提高疫苗效价、降低应激反应的有效手段,精制疫苗将成为今后发展的必然趋势。由于本人仅专注于纯化工艺的开发,文中错误还望各位读者批评指正,互相学习,共同进步!

作者简介

易国军,武汉汇研生物科技股份有限公司创始人,现担任武汉汇研生物科技股份有限公司的董事长及研发主管。曾参与国家863计划和科技部创新基金,超过七年生物分离纯化介质的研发生产经验,已为多家动物疫苗企业提供分离纯化工艺解决方案。

发表于 2017-5-2 08:45:06 | 显示全部楼层 |阅读模式

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